材料和试剂

纯化的蛋白质（储备溶液优选浓度高于20μM）（Murphy等人，2013）
1μM二硫苏糖醇（DTT）储液（Astral Scientific，目录号：C-1029）
DMSO（高级）（Sigma-Aldrich，目录号：D-1435）
MilliQ水
核苷酸溶液（在20mM Tris中制备的10mM储备液）（pH 8）
1. ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
2. ADP（Sigma-Aldrich，目录号：A2754）
3. AMP-PNP（Sigma-Aldrich，目录号：A2647）
4. GTP（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
二价阳离子盐溶液（50mM储备液，在MilliQ水中）
1. MnCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：203734）
2. MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
激酶抑制剂溶液（100mM DMSO中的2mM储备液）（例如泛激酶抑制剂，Staurosporine，Sigma-Aldrich，目录号：S5921）
热漂移测定缓冲液（参见配方）
SYPRO Orange（Sigma-Aldrich，目录号：S5692）（参见配方）

设备

RT-PCR管GST-RG01（Gene Targets Solutions）
1.5ml微量离心管
Qiagen/Corbett Rotor-Gene 3000 RT-PCR机器（QIAGEN）（Murphy等人，2013）

软件

Microsoft Excel或Prism

程序

热迁移测定（TSA）测试运行以测定蛋白质的最佳量
1. 准备您的蛋白质样品在缓冲液中的稀释系列从1 至10μM的最终浓度，总体积为25μl。加入1μl的1x SYPRO ^®橙色到每个管
2. 使用进行热循环仪运行参数如步骤3所述。分析熔体曲线（参见步骤 4），并确定给出至少30的蛋白质的最佳量荧光单元。如果荧光信号减少蛋白质的量饱和。
  注意：典型的最终蛋白质浓度为约5 μM。 Rotor-Gene 3000配备具有增益优化功能可以调整为最佳信号（参考制造商的手动）。
测定
1. 首先定义您需要测试的条件数，包括适当的控制，如蛋白质样品在缓冲液中，如果测试核苷酸结合，或在DMSO的存在下，如果测试化合物。这将确定蛋白质所需的总混合物的总体积进行整个实验。每个反应总共进行体积为25μl。
2. 准备在冰上，只是之前使用主混合含有您的蛋白质在热漂移测定缓冲液中使用产生峰值荧光的蛋白质浓度（无信号饱和度）。
3. 分配23微升蛋白质/缓冲液，加1 μl的配体（10至200μM）或1μl的DMSO /缓冲液作为对照实验和1μl稀释的SYPRO（R）Orange（1:100）。准备管重复。如果要测试的蛋白质在室内高度不稳定温度，建议在冰上准备管。核苷酸溶液通常以200μM的终浓度使用，最终为1mM的二价阳离子和最终为40μM的激酶抑制剂。
热循环程序
1. 基于荧光的热漂移测定可以使用结合样品温度控制和染料的仪器荧光检测。在这种情况下，我们使用Qiagen/Corbett Rotor-Gene 3000 RT-PCR机。
2. 从25℃开始，保持在25℃ 持续2分钟，以1℃/min的温度升高65个循环（25℃至90℃） °C），每°C读取荧光强度。返回到25°C。励磁是在470nm（绿色通道），发射是在555nm（黄色通道）。
数据分析
1. 将数据保存为荧光强度与温度。导出文件中的格式适合导入到Microsoft Excel或Prism进行分析
2. 最高荧光密度用作数据的截止值，因此在高荧光密度峰后去除所有数据。适合荧光强度曲线与使用Prism的Boltzmann S形曲线。
3. 获得蛋白质的熔解温度（T m）缓冲液/DMSO，其对应于蛋白质解折叠的中点曲线。类似地，当加入配体时获得蛋白质的T m。
4. 计算ΔTsub = T sub配体-T sub缓冲液/DMSO。正ΔTm表示配体稳定蛋白质免于变性，因此结合蛋白质。值≥2-3℃是配体结合的指标。
5. 以下是典型的TSA实验的示例。
  注意：如果PRISM软件不可用，则非线性回归分析实验数据可以使用Microsoft Excel电子表格进行（Brown，2001）。
图1. TSA实验的实例。（顶部）在存在和不存在核苷酸的情况下获得小鼠MLKL的热迁移测定数据。在不存在配体的情况下，解折叠转变的中点被观察到为44.8℃，而在ATP存在下T m移动到53.8℃，诱导9℃的位移。（底部）总结在ATP，GTP和AMPPNP存在下对mMLKL获得的T m和ΔTm值的表。

食谱

热移动分析缓冲区
可以根据每种蛋白质来优化用于稀释蛋白质的缓冲液的组成。以下配方用于研究假性激酶 20mM Tris（pH8）
150mM NaCl 1 mM DTT
SYPRO ^®橙色
在100％高等级DMSO中1至100稀释

笔记

虽然单个结构域蛋白的热变性主要导致单个过渡阶段，多结构域蛋白可以展现不同的过渡态。然而，如果配体紧密结合到一个结构域，其可以导致热变性曲线的变化，提供用于测定配体结合的易处理方法。还存在配体可以紧密结合但不诱导T m1变化的情况。
所描述的方案已经适应于Qiagen/Corbett Rotor-Gene 3000 RT-PCR机。每次实验所需的蛋白质量和SYPRO橙色稀释液可能需要根据所使用的RT-PCR机器进行调整。

致谢

我们感谢蒙纳士大学蛋白生产单位访问用于热迁移测定开发的Corbett RT-PCR仪器。这项工作得到国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）资助（1016647,461221,1016701,637342,1025594,1046984）和与J.M.H.，N.A.N.的研究金的支持。和J.S。澳大利亚研究委员会与P.E.C.，J.J.B.和J.M.M。以及来自澳大利亚癌症研究基金，维多利亚州政府运营基础设施支持和NHMRC IRIISS拨款（361646）的额外支持。该测定是在完成以下研究的过程中开发的：Murphy等人（2013）和Murphy等人（2014）。

参考文献

Brown，A.M。（2001）。使用Microsoft Excel电子表格对实验数据进行非线性回归分析的分步指南。 Comput 方法程序Biomed 65（3）：191-200。
James，M.M.，Isabelle，S.L.，Joanne，M.H.，Maria，C.T.，Samuel，N.Y.，Pooja，S.，Guillaume，L.，Warren，S.A.，Jeffrey，J.B.and John，了解人类和小鼠MLKL的晶体结构所显示的假性激酶之间不同核苷酸结合机制的演变。 Biochem J ，457（3）：369-377。
本发明的另一个方面涉及一种用于治疗和/或预防糖尿病的方法，所述方法包括以下步骤Varghese，LN，Tannahill，GM，Hatchell，EC，Majewski，IJ，Okamoto，T.，Dobson，RC，Hilton，DJ，Babon，JJ，Nicola，NA，Strasser，A.，Silke，（2013年）。假性激酶MLKL介导坏死病通过分子开关机制。免疫 39（3）：443-453。
Murphy，JM，Zhang，Q.，Young，SN，Reese，ML，Bailey，FP，Eyers，PA，Ungureanu，D.，Hammaren，H.，Silvennoinen，O.，Varghese，LN，Chen，K.，Tripaydonis ，A.，Jura，N.，Fukuda，K.，Qin，J.，Nimchuk，Z.，Mudgett，MB，Elowe，S.，Gee，CL，Liu，L.，Daly，RJ，Manning，，Babon，JJ和Lucet，IS（2014）。一种基于其核苷酸结合性质将假性激酶分类的可靠方法。 Biochem J 457（2）：323-334。