材料和试剂

寄生虫培养
1. 恶性疟原虫（例如克隆系3D7）
2. 无菌，人类0 ⁺红细胞浓缩物（血库）
3. RPMI完全培养基（见配方）
  1. RPMI-1640（AppliChem GmbH，目录号：A1538,9010）
  2. NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
  3. 葡萄糖（Merck KgaA，目录号：1.08342.1000）
  4. Albumax II（Life Technologies，Gibco ，目录号：11021-037）
  5. 次黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：H9636）
  6. 40 mg/ml庆大霉素（Ratiopharm）
寄生虫蛋白提取
1. 山梨醇（Sigma-Aldrich）
2. Triton X-114（Enzo Life Sciences）
3. 10x PBS（请参阅配方）
4. 0.03％皂苷裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S4521）（参见Recipes）
5. 寄生虫裂解缓冲液（见配方）
6. Tetanolysin（List Biological Labs，目录号：199）（参见Recipes）
7. 25x蛋白酶抑制剂混合物迷你（Roche Diagnostics，目录号：11836170001）（参见Recipes）
8. Percoll溶液（GE Healthcare，目录号：17-0891-02）（参见Recipes）
SDS-PAGE和western印迹分析
1. PageRuler预染蛋白梯子（Thermo Fisher Scientific）
2. Tris（Merck KGaA）
3. CAPS（Sigma-Aldrich）
4. SDS（SERVA Electrophoresis GmbH）
5. 低脂奶粉（印迹级）（Carl Roth，目录号：T145.2）
6. ECL溶液/Western印迹检测试剂盒（Pierce抗体）
7. 抗体（例如小鼠抗GFP，Roche Diagnostics，目录号： 11814460001; 辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠，dianova GmbH，目录号：115-035-062）
8. 电泳缓冲液（参见配方）
9. 5x SDS样品缓冲液（见配方）
10. 1 M Tris缓冲液（pH 6.8）（参见配方）
11. 1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）（参见配方）
12. 具有5％堆积凝胶和12％分离凝胶的聚丙烯酰胺凝胶（参见配方）
13. CAPS缓冲液（1L，10mM，pH 11.3）（参见配方）
14. 封闭溶液（50ml）（见配方）

设备

Falcon管（15ml，50ml）
离心机
Eppendorf管（1.5ml，2ml）
灭菌过滤器（0.22μm）
热块
凝胶电泳室（Bio-Rad Laboratories）
硝酸纤维素印迹膜（Whatman，Protran ）
色谱纸（3级MM CHR）（GE Healthcare）
罐印迹装置（Bio-Rad Laboratories）
滚动装置
透明纸张
开发人员（Agfa-Gevaert Group）
开发录音带
X光胶片（Agfa-Gevaert Group）

程序

注意：所有离心步骤均在室温下进行。

寄生虫蛋白提取
1. 皂苷裂解除去可溶性PV含量，宿主细胞胞质溶胶和uRBC。
  1. 离心10毫升恶性疟原虫培养物（5-10％寄生虫血症）以500×g离心5分钟，弃去上清液并重悬在10ml 1x PBS中的沉淀。再次离心，在4中重悬沉淀 ml皂苷裂解缓冲液（0.03％），并在冰上孵育5-20分钟
  2. 在16,000×g离心裂解物5分钟以沉淀寄生虫并用1×PBS反复洗涤沉淀，直至上清液显示没有红色了。
    注意：通常需要执行3个清洗步骤。
  3. 弃去上清液，加入2-8μl25x蛋白酶抑制剂鸡尾酒。根据寄生虫颗粒的大小，重悬沉淀在50-200μl寄生虫裂解缓冲液中。
    注意：一般100μl 寄生虫裂解缓冲液将用于10ml> 5％的寄生虫培养物，寄生虫，但这取决于裂殖体阶段的比例寄生虫作为这些阶段包含大量的DNA。加入DNase即可用于降低提取物的粘度。
  4. 如果不立即用于SDS-PAGE，提取物可以储存在-20℃。
2. Percoll梯度以获得完整的iRBC，随后皂甙裂解单独的可溶性宿主细胞和PV含量与寄生虫材料。
  1. 离心10毫升恶性疟原虫培养物（5-10％寄生虫血症）以500×g离心5分钟，弃去上清液并重悬在10ml 1x PBS中的沉淀。再次离心并取出上清液
  2. 通过添加前500个准备percoll渐变 μl80％percoll溶液到2ml试管中，然后仔细分层500μl 60％percoll溶液在80％percoll顶部，最后分层 500μl40％percoll溶液在60％percoll顶部（图1， Percoll梯度）。
    注意：立即使用渐变。
  3. 用200μl1×PBS重悬沉淀，并缓慢吸取寄生虫溶液在梯度顶部。立即以16,000×g离心5分钟。
    注意：在添加寄生虫时，用移液器尖端触摸管的侧面，以避免溶液混合。
  4. 小心地收集所需的寄生虫阶段带到一个新的1.5毫升（参见图1，用于从梯度中选择正确的相）和加入1ml 1×PBS。
    注意：如果太多的percoll溶液被转移，例如如果没有明显的iRBC阶段（图1A，情景 3），在第一洗涤步骤后寄生虫可能不会适当地沉淀。在这种情况下，只有在离心后才去除顶部区域首先洗涤，并再次用1x PBS代替整体 percoll浓度的溶液。 iRBC应该沉淀在下一次离心步骤后。
  5. 以16,000×g离心5分钟，并用1ml 1×PBS洗涤寄生虫沉淀至少3次。
    注意：每个洗涤步骤都使用新鲜管。
  6. 将沉淀重悬在50μlPBS中，然后加入50μl皂苷裂解缓冲液（0.03％），并在冰上孵育5分钟。
  7. 在16,000×g离心裂解物5分钟。转移皂苷上清液置于新管中（宿主细胞细胞溶质和PV的最终提取物内容物）并加入4μl25x蛋白酶抑制剂混合物。提取物可以如果不立即用于SDS-PAGE，则储存在-20℃
  8. 用1×PBS洗涤沉淀，直至上清液澄清注意：通常需要执行3个清洗步骤。
  9. 加入4微升25x蛋白酶抑制剂混合物到沉淀。重新悬挂沉淀在100μl寄生虫裂解缓冲液中。提取物可以在-20℃保存 °C，如果不立即用于SDS-PAGE
  图1. Percoll渐变和结果。 A.准备/设置Percoll渐变没有和与寄生虫培养（左上）。后三种可能的结果离心显示在"结果"（右上）：1）一条带主要由碎片，裂殖子和分段裂片组成 40％Percoll和水性区域之间的边界（存在于离心后40％percoll）和uRBC /环阶段上方的一条带区域由更年轻的裂殖体和滋养体组成（这是分数收获。 2）外观类似于1）但具有多个碎片/裂殖子/分段裂殖相下的带;这些频段通常由不同阶段的iRBC组成，并且可以全部收集; 3）没有明确界定的带;在这种情况下收集指示的部分（从中间40％到刚好在uRBC和环状阶段上方的区域相，确保不干扰此阶段）。虽然在这种情况下阶段可能太分散以致不能看作是清楚的带梯度，这通常仍然会导致一次好的恢复沉淀并洗涤。 B.用i。感染的iRBC的纯化的实施例 PF13_0191-GFP寄生虫。 GFP，PF13_0191-GFP荧光; DIC，微分干涉对比;合并，两个图像合并。
3. Percoll梯度和连续用溶组织蛋白酶和皂苷处理以获得宿主细胞胞质溶胶和PV含量的提取物，分别。
  1. 执行步骤A2a-e。
  2. 重新悬挂寄生虫沉淀在99μl1×PBS中，并加入1μl溶组蛋白溶酶（1μg/ml）。用手指翻转管子立即混合溶液。在37℃孵育30分钟。
    注意：溶支原体活性可能不同与批次和取决于冻融循环的次数使用等分试样。如果需要标准化结果，活动测试用 uRBCs可以在每次使用前进行。对于这个孵化系列溶组织素溶液用20μl70％血细胞比容RBCs稀释1分钟 37℃，然后立即以16,000×g离心3分钟至评估裂解（剩余的uRBCs沉淀）。对于percoll丸使用10x 只溶解所有20μluRBC所需的溶胀素的量。注意，在percoll后获得的寄生虫的实际数量纯化也影响裂解效率。
  3. 离心机裂解物以16,000×g离心5分钟。转移溶组织蛋白酶上清液到新管（宿主细胞细胞溶质的最终提取物），并加入4μl25x 蛋白酶抑制剂混合物。如果没有，提取物可以储存在-20℃ 立即用于SDS-PAGE。
  4. 用1×PBS洗涤沉淀，直至上清液澄清
  5. 将沉淀重悬于50μl1x PBS中，加入50μl皂苷裂解缓冲液，在冰上孵育5分钟。
  6. 执行步骤A2g-i。
寄生虫蛋白提取物的SDS-PAGE和western印迹分析
1. SDS页
  1. 准备一个聚丙烯酰胺凝胶与5％堆叠和12％分离凝胶，0.75毫米厚度
  2. 将（解冻的）寄生虫蛋白质提取物以16,000×g离心5分钟，并将上清液转移到新管中。
  3. 加入所需量的5×SDS样品缓冲液，并在95°C孵育5分钟注意：如果加热，一些多跨膜蛋白可以聚集，然后可以将提取物温热至50℃。
  4. 加载预染蛋白梯（4微升）和8微升的提取物电泳室中凝胶的狭槽充满电泳缓冲液，并在200V下运行凝胶1小时。
2. 蛋白质印迹分析
  1. 浸泡硝酸纤维素膜和6片色谱纸，切成10mM CAPS（pH 11.2）中的凝胶大小。
  2. 按以下顺序准备印迹：阳极（+），海绵，3页的层析纸，硝酸纤维素膜，SDS凝胶，3 色谱纸，海绵，阴极（ - ）。
  3. 在罐式印迹装置中以15V /凝胶和4℃过夜进行蛋白质转移
  4. 拆除印迹夹心，立即将膜转移到1x PBS进行短暂冲洗。
    注意：凝胶可以用考马斯染色以检查有效转移。
  5. 在室温下，在滚动装置上，在50ml Falcon管中用10ml封闭溶液孵育膜1小时。
  6. 用5ml新鲜封闭溶液替换封闭溶液。添加5 μl第一抗体（例如小鼠抗GFP 1：1,000）至阻断溶液，并在室温下将膜孵育3小时滚动装置
  7. 用10-20ml 1×PBS在室温下在滚动装置上洗涤膜5x5分钟
  8. 稀释1.7μl第二抗体（例如辣根）过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠1:3,000）的5ml封闭溶液中并在室温下在滚动上孵育膜1小时设备。
  9. 用10-20ml 1×PBS在室温下在滚动装置上洗涤膜5x5分钟
  10. 孵育膜与足够的ECL溶液覆盖的印迹（1.5-3ml）在室温下在滚动装置上5分钟
  11. 将膜转移到2层透明片材之间。在黑暗中适用于不同时间的X光胶片。
  12. 在开发者中开发X射线胶片。

食谱

RPMI完全培养基（1L）
15.87g RPMI-1640
1g NaHCO 3 3/h 2 g葡萄糖 5克Albumax II
0.0272g次黄嘌呤 0.5 ml庆大霉素
用盐酸调节pH至7.2 将dH <2> O添加到1 L
过滤灭菌（0.22μm）并在4℃下保存
10x PBS（1L）
5.7g Na 2 HPO 4。 1.25g NaH 2 PO 4 sub/d 15.2g NaCl
将pH调节至7.4
将dH <2> O添加到1 L
0.03％皂苷裂解缓冲液（50ml）将0.0015g皂苷与50ml 1x PBS混合
储存于4°C长达1个月
寄生虫裂解缓冲液（10ml） 4ml 10％SDS（4％最终） 0.5ml 10％Triton X-114 5 ml 1x PBS
0.5ml dH 2 O 2 /
溶血素在dH 2 O中溶解为1μg/μl
制作等份
25x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
将1片溶于400μldH 2 O中溶解，并储存于-20℃下。
Percoll溶液
90％（50ml）：将45ml Percoll与5ml 10×PBS混合物
80％（10ml）：将0.8g山梨醇与8.9ml 90％Percoll和1.1ml RPMI完全培养基混合
60％（10ml）：将0.8g山梨醇与6.7ml 90％Percoll和3.3ml RPMI完全培养基混合
40％（10ml）：将0.8g山梨醇与4.4ml 90％Percoll和5.6ml RPMI完全培养基混合
过滤灭菌（0.22μm）并在4℃下保存
电泳缓冲液（1 L）
3.03g Tris
14.4g甘氨酸
1克SDS
将dH <2> O添加到1 L
5×SDS样品缓冲液（50ml） 1.82g TrisHCl（pH 6.8）
5克SDS
25ml甘油 3.86 g DTT
0.05％溴酚蓝
将dH <2> O添加到50ml
1M Tris缓冲液（pH6.8）（1L）将121.1g Tris与800ml dH 2 O混合用HCl将pH调节至6.8，并将dH 2 O加至1L
1.5M Tris缓冲液（pH8.8）（1L） 181.65g Tris与800ml dH 2 O
用HCl将pH调至8.8，并将dH 2 O加至1L
5％堆积凝胶（2凝胶） 0.75ml 1M Tris（pH6.8）
4.35ml dH 2 O·dm / 0.75ml 40％丙烯酰胺 6μlTEMED
60μl10％SDS
60微升10％APS
12％分离凝胶（2块凝胶） 2.5ml 1.5M Tris（pH8.8）
4.2ml dH 2 O 2 / 3ml 40％丙烯酰胺 4μlTEMED
100μl10％SDS
100μl10％APS
CAPS缓冲液（1L，10mM，pH 11.3）在800ml dH 2 O中的2.21g CAPS 用氢氧化钠将pH调至11.3，并将dH 2 O加至1L
封闭溶液（50ml）
将2.5g奶粉与50ml 1x PBS混合，
保持在4°C

致谢

在p中使用成孔毒素。 falciparum 是由Lingelbach实验室率先开发的：Ansorge等人（1996）。 Percoll梯度是来自Aley等人的方案的修改版本（1986）。

参考文献

Aley，S.B.，Sherwood，J.A.，Marsh，K.，Eidelman，O。和Howard，R.J。（1986）。鉴定山梨醇富集的恶性疟原虫感染的红细胞上的分离物特异性蛋白来自冈比亚病人。寄生虫学 92（第3篇）：511-525。
Ansorge，I.，Benting，J.，Bhakdi，S。和Lingelbach，K。（1996）。在恶性疟原虫感染的红细胞中透过细胞透化的红细胞中的蛋白质分选形成蛋白链球菌溶血素O. 生物化学杂志315（第1篇）：307-314。
Heiber，A.，Kruse，F.，Pick，C.，Gruring，C.，Flemming，S.，Oberli，A.，Schoeler，H.，Retzlaff，S.，Mesen-Ramirez，P.，Hiss，JA ，Kadekoppala，M.，Hecht，L.，Holder，AA，Gilberger，TW和Spielmann，T。（2013）。新PNEP的鉴定表明实质的非PEXEL exportome并且支持恶性疟原虫的常见特征蛋白质导出。 PLoS Pathog 9（8）：e1003546。