（Hp）排泄/分泌（ES）产物（HES）的产生和收集

材料和试剂

成人L5 Heligmosomoides poylgyrus （Hp）
50ml PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-015）
完全RPMI（GE Healthcare，目录号：E15-840）
10,000 MWCO纤维素膜（EMD Millipore，Centriprep ）
EndoTrap Blue 5/1 LPS结合亲和柱（Hyglos GmbH，目录号：311063）
HES洗涤溶液I（参见配方）
HES洗涤溶液II（参见配方）
HES培养溶液（参见配方）

设备

铝箔
50ml Falcon管（BD，目录号：352070）
移液器
Falcon烧瓶（TPP Techno Plastic Products，目录号：90076）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
佩尔蒂菜
显微镜（OLYMPUS，型号：CKX31）
层流气流柜（更快的Ultrasafe，型号：US218D）

程序

在使用层流气流柜的情况下工作无菌
在50ml Falcon管中，在无菌的50ml PBS中大量洗涤成体L5 Hp
通过倒置Falcon瓶混合。等待1-5分钟，直到L5 Hp沉到烧瓶底部，然后使用移液管除去尽可能多的上清液。
对3x重复步骤1-2。
将L5 Hp转移到50mL洗涤溶液I中，如先前Camberis等人（2003）所述。
通过翻转Falcon管混合。等待1-5分钟，直到L5 Hp沉到烧瓶底部，然后尽可能多地除去上清液
对3x重复步骤4-5。
转移沉降L5 Hp到新的50毫升Falcon管使用10毫升吸管，轻轻吸取蠕虫的50毫升管的底部，充满50毫升与洗涤溶液II。
通过倒置混合，并在室温下孵育1小时
计数L5 Hp蠕虫通过使用解剖显微镜转移到perti菜
将转移沉降的L5 Hp蠕虫在HES培养溶液中以100蠕虫/ml转移到合适的细胞培养瓶中。
在37℃下在具有5％CO 2的细胞培养隔离器中孵育
每2天使用移液管收集上清液，持续2周，然后无菌过滤，并使用摇摆转子在4,000×g，25°下通过10,000MWCO纤维素膜离心浓缩上清液 C，起始体积为15ml。用等体积的培养溶液更新蜗杆培养瓶中的培养基。使用NanoDrop测量浓缩HES中的蛋白质浓度
根据制造商的说明，使用EndoTrap Blue LPS结合亲和柱从HES培养物上清液中去除LPS污染物。

食谱

HES洗涤溶液I
500 ml PBS
2ml庆大霉素试剂溶液（50mg/ml） 10ml 100×青霉素 - 链霉素溶液（10,000U/ml）
HES洗液II
500ml RPMI 1640
2ml庆大霉素试剂溶液（50mg/ml） 10ml 100×青霉素 - 链霉素溶液（10,000U/ml）
HES培养液
500ml RPMI 1640
1ml庆大霉素试剂溶液（50mg/ml） 5ml 100x青霉素 - 链霉素溶液（10,000U/ml） 50ml 10％葡萄糖

第二部分。鉴定蠕虫诱导的2型CD4 ⁺ T细胞

材料和试剂

来自Hp感染的小鼠的肠系膜淋巴结（MLN）
台盼蓝（Life Technologies，Gibco ，目录号：15250-061）
完全RPMI（GE Healthcare，目录号：E15-840）
PMA（佛波脂肉豆蔻酸乙酸酯）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I9657）
布雷菲德菌素A（Sigma-Aldrich，目录号：B7651）
PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-015）
BSA（Roche Diagnostics，目录号：10735108001）
活/死可固定水性死细胞染色试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：L34957）
PFA（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
EDTA（AppliChem GmbH，目录号：A3145）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

铝箔
70μm细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：22363548）
50ml Falcon管（BD，目录号：352070）
Neubauer计数室（Assistent ^®）
孵育器（Thermo Fisher Scientific，Heracell ^TM 150i）
96孔细胞培养板（Corning，Costar ，目录号：3799）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
显微镜（OLYMPUS，型号：CKX31）
BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）

程序

在冰和无菌条件下工作。
从Hp感染的小鼠中取出肠系膜淋巴结（MLN），并置于完全的RPMI在冰上（确保删除MLN的所有脂肪组织，然后将其存储在完整的RPMI）。
粉碎MLN通过放置在50ml Falcon管上的70μm细胞过滤器并用20ml完全RPMI冲洗。
使用台盼蓝和血细胞计数器（Neubauer计数室）在捣碎的MLN细胞悬浮液中计数活细胞。
在37℃，5％CO 2 。
在培养箱中保持细胞72小时。
在4℃下将96孔板在400×g离心5分钟
弃去上清液（或在-20℃冷冻用于进一步的细胞因子分析）
将细胞重悬于补充有PMA（10μM至10μM）和离子霉素（1μg/ml）的100μl完全RPMI中。
在37℃下用5％CO 2孵育另外2小时
加入100μl补充有20μg/ml布雷菲德菌素A的完整RPMI
在37℃下用5％CO 2孵育另外2小时
在4℃下将96孔板在400×g离心5分钟
通过使用含有0.2％BSA的相同200μlPBS一个接一个地重悬，将三份重复混合到单个孔中。
在4℃下以400×g离心5分钟。
用含0.2％BSA的200μlPBS重悬
在4℃下以400×g离心5分钟。
用50μl/孔24G2作为FcR阻断（从细胞系培养物上清液获得）（来自贮备液1mg/ml储备溶液的1:800稀释液）重悬10分钟。
在4℃下以400×g离心5分钟，并重悬于200μl含有0.5％BSA的PBS中。
在4℃下以400×g离心5分钟，并根据制造商的说明书重悬于100μl含有补充有活/死可固定水性死细胞染色试剂盒的0.5％BSA的PBS中。
在4℃下以400×g离心5分钟，并重悬于200μl含有0.5％BSA的PBS中。
在4℃下以400×g离心5分钟，并重悬于含有0.5％BSA的50μlPBS中，包括标记有用于FACS分析的细胞表面抗体。
在黑暗中孵育，例如。用铝箔覆盖30分钟。
在4℃下以400×g离心5分钟，并重悬于200μl含有0.5％BSA的PBS中。
重复步骤24.
在4℃下以400×g离心5分钟，并在含有2％PFA的PBS中重悬20分钟以固定。
在4℃下以400×g离心5分钟，并重悬于200μl含有0.5％BSA的PBS中。
重复步骤27.
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液，并重悬于100μl皂苷（用含0.2％BSA的PBS稀释10倍）中以透化细胞。
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液，并重悬于50μl添加有用荧光标记的细胞内细胞因子抗体的皂苷中，用于FACS分析。
在黑暗中孵育，例如用铝箔覆盖40分钟。
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液，并重悬于200μl皂苷中
重复步骤32.
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液，并重悬于200μl含0.5％BSA的PBS中
重复步骤34.
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液并重悬于75μlFACS缓冲液中
在70μm细胞过滤器中过滤细胞
在LSRII获取单元格。

食谱

FACS缓冲区
500 ml PBS
25 ml BSA（10％） 20ml EDTA（20mM）

第三部分。鉴定蠕虫诱导的ILC2s

材料和试剂

肠系膜淋巴结（MLN）和来自Hp感染的小鼠的脾
完全RPMI（GE Healthcare，目录号：E15-840）
PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-015）
BSA（Roche Diagnostics，目录号：10735108001）
活/死可固定水性死细胞染色试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：L34957）
生物素标记的细胞表面抗体（Biolegend）
1. CD3（克隆：145-2C11）
2. CD4（克隆：GK1.5）
3. CD11b（克隆：M1/70）
4. CD11c（克隆：N418）
5. CD19（克隆：6D5）
6. Nk1.1（克隆：PK136）
7. Ly6G（克隆：1A8）
8. IgE（克隆：RME-1）
C-kit（CD117）Pacific Blue（克隆：2B8）（Biolegend）
sca-1（Ly-6A/E）PE-Cy7（克隆：D7）（eBioscience）
T1/ST2 FITC（克隆：DJ8）（MD Bioproducts）
ICOS（CD278）PerCp-Cy5.5（克隆：C398.4A）（Biolegend）
链霉亲和素PE-TexasRed（BD Biosciences）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

70μm细胞过滤器
50ml Falcon管
3 ml注射器柱塞
96孔板
BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）

程序

在冰上工作。
从Hp感染的小鼠中取出肠系膜淋巴结（MLN）和脾脏，将其置于冰上的完全RPMI中（确保在将它们储存在完全RPMI中之前除去MLN和脾脏的所有脂肪组织）。
粉碎MLN和脾通过使用3ml注射器柱塞并置于50ml Falcon管上的70μm细胞过滤器，并用20ml完全RPMI冲洗。
在捣碎的细胞悬浮液中计数活细胞
在单个圆底96孔中，在含有0.2％BSA的200μlPBS中转移至1×10 6个细胞。
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液。
用含0.2％BSA的200μlPBS重悬
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液。
用50μl/孔24G2（来自原液1mg/ml储备溶液的1:800稀释液）重悬10分钟。
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液，并重悬于200μl含0.5％BSA的PBS中
在4℃下以400×g离心5分钟，并根据制造商的说明书重悬于100μl含有补充有活/死可固定水性死细胞染色试剂盒的0.5％BSA的PBS中。
在单个圆底96孔中，在含有0.2％BSA的200μlPBS中转移至1×10 6个细胞。
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液。
用含0.2％BSA的200μlPBS重悬
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液。
用50μl/孔24G2（来自原液1mg/ml储备溶液的1:800稀释液）重悬10分钟。
在4℃下以400×g离心5分钟。离心后弃去上清液，并重悬于200μl含0.5％BSA的PBS中
在4℃下以400×g离心5分钟，并根据制造商的说明书重悬于100μl含有补充有活/死可固定水性死细胞染色试剂盒的0.5％BSA的PBS中。
...
Incubate in the dark, e.g. cover with aluminum foil for 30 min.
Centrifuge at 400 x g for 5 min at 4 °C. Discard supernatant after centrifugation and resuspend in 200 μl PBS with 0.5% BSA.
Centrifuge at 400 x g for 5 min at 4 °C. Discard supernatant after centrifugation and resuspend in 50 μl PBS with 2% PFA for 20 min for fixation.
Centrifuge at 400 x g for 5 min at 4 °C. Discard supernatant after centrifugation and resuspend in 200 μl PBS with 0.5% BSA.
Repeat step 20.
Centrifuge at 400 x g for 5 min at 4 °C. Discard supernatant after centrifugation and resuspend in 75 μl FACS buffer.
Filter cells in a 70 μm cell strainer.
Acquire cells at the LSRII.
Gating strategy is shown in Figure 1:

Figure 1. Gating strategy used to identify ILC2s. ILC2 cells were identified as lineage-negative (Gr-1, CD3, CD19), Sca-1, c-kit, T1/ST2 and ICOS positive live cells present in the spleen of mice at 6 days post infection with the helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. Y-axis represents counts if not otherwise indicated.

Recipes

FACS缓冲区
500 ml PBS
25 ml BSA（10％） 20ml EDTA（20mM）

致谢

该协议是Zaiss等人（2013）中描述的扩展版本。研究获得了欧洲共同体第七框架计划[FP7/2009-2014]在EC-GA no [241642]下的资助，这项工作的一部分由瑞士国家科学基金会和关节炎研究所资助。 KMM由EMBO长期研究金和澳大利亚NHMRC博士后研究金支持。

参考文献

Camberis，M.，Le Gros，G。和Urban，J.，Jr。（2003）。巴西尼罗河线虫动物模型和 Heligmosomoides polygyrus >。 Curr Protoc Immunol Chapter 19：Unit 19 12.
Zaiss，M.M.，Maslowski，K.M.，Mosconi，I.，Guenat，N.，Marsland，B.J.and Harris，N.L。（2013）。 IL-1beta抑制先天性IL-25和IL-33的产生，并维持蠕虫的长期性。 PLoS Pathog 9（8）：e1003531。