材料和试剂

C57BL6（CD45.2）小鼠（在我们的实验室培育）
C57BL6（CD45.1）小鼠（在我们的实验室培育）
环丙沙星200（200mg/100ml Bayer）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（不含Ca 2+和Mg 2+ 2+）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
Turk溶液（Merck KGaA，目录号：1.09277.0100）
肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H3393-100KU）
Ficoll-Paque plus（GE Healthcare，目录号：17-1440-03）
FITC抗小鼠CD45.1（克隆A20）（Biolegend，目录号：110705）
PE抗小鼠CD115（克隆AFS98）（Biolegend，目录号：135506）
APC抗小鼠B220（克隆RA3-6B）（eBioscience，目录号：17-0552-81）
FITC抗小鼠Gr-1（克隆RB6-8C5）（Biolegend，目录号：108405）
APC抗小鼠Ter119（克隆TER-119）（Biolegend，目录号：116211）
PE抗小鼠CD3（克隆145-2C111）（Biolegend，目录号：100307）
APC抗小鼠NK1.1（克隆PK136）（Biolegend，目录号：108709）
链霉亲和素PerCp（Biolegend，目录号：405213）
叠氮化钠
FACS缓冲区（参见配方）
RBC裂解缓冲液（参见配方）
肝素溶液（见配方）

设备

3ml注射器（BD Biosciences，目录号：305270）
镊子和锋利的剪刀
针（21G×1.5-Nr.2.8mm×40mm）（BD Biosciences，目录号：304432）
0.5ml注射器（BD，目录号：320933）
鼠标限制器
红光灯
组织培养（TC）皿（6孔板）（Corning，目录号：3516）
15ml锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352196）
70μM尼龙滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352350）
倒置显微镜
冰桶
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629-1EA）
离心机
手术刀
Eppendorf管（Axygen ，目录号：MCT-175-C）。
FACS微管（USA Scientific，目录号：1412-1000）
FACS管（BD，目录号：352054）
小鼠照射机（Gamma cell 40 Exactor）（InsideView）
BD LSR II流式细胞仪

软件

FACSDiva软件
FlowJo软件

程序

第I部分：骨髓移植
在开始之前，重要的是要理解以下方案设计用于测试期望的转基因供体的竞争性骨髓重建。竞争总是与野生型同类C57BL6 CD45.1骨髓细胞。用竞争剂测试合适的野生型对照细胞的竞争是至关重要的，并且总是在测试的供体和它们的野生型对照之间进行比较。

移植前一天
用9.5Gy全身照射（TBI），（Gamma细胞40外泌机）照射辐射C57BL6（CD45.2）宿主雌性（每个移植组5只小鼠）。在暴露于TBI后，用1:100稀释的环丙沙星200补充饮用水。补充抗生素的水不应暴露于光。
注意：小鼠是8周龄，并根据Gamma细胞40生物反应器机器9.5Gy或950rad辐照。时间是根据机器的校准。

移植日期

通过CO 2安乐死或颈脱位来牺牲C57BL6供体小鼠（CD45.2）和C57BL6竞争小鼠（CD45.1）。
使用镊子和锋利的剪刀提取后肢。将骨头放在冰上的PBS中。我们通常将每组2-3只小鼠的骨骼混合，如果不合并小鼠，则在6孔板的不同孔中分离单独的骨。
为了能够正确识别供体（CD45.2）和竞争对手（CD45.1）的骨骼，必须在6孔板中标记孔。
使用3ml注射器和21G×1.5针，用5ml冰冷PBS（5ml，每只小鼠15ml试管）从骨腔（小鼠的两肢）冲洗总骨髓细胞。为了分离骨髓细胞，使用相同的注射器重悬5ml的细胞溶液
将5毫升细胞悬浮液通过70微米尼龙过滤器，得到均匀的单细胞悬浮液
通过用Turk's溶液稀释细胞1：5-1：10计数细胞（5ml）。使用血细胞计数器在倒置光学显微镜下计数细胞，计数所有9个正方形。从一只小鼠，通常将从股骨和胫骨获得50百万个细胞。
计数细胞是关键的一步;细胞计数的错误可能会产生错误的结果。我们通常使用Turk的解决方案对来自三次独立稀释的重复样本进行计数。（如果1:10稀释得到非常低的计数，小于40个细胞，降低稀释因子，最准确的计数应该在50-200个细胞之间）。
每个样品中每毫升的细胞计数是细胞数：细胞计数x稀释因子×10 4 。
竞争性BM移植通常通过移植1：1比例的供体与竞争性骨髓细胞来实现。如果需要，可以改变移植比例。
移植1：1比率：将总共500万个细胞移植到每个宿主;对于对照，分别移植供体和竞争细胞。（每个对照组5个宿主小鼠）。

根据下表制备供体和竞争细胞的PBS中的细胞混合物：

实验组1：竞争性1：1测试组移植	实验组2：竞争性1：1控制移植
12.5×10 6个细胞/ml受试供体 12.5×10 6个细胞/ml竞争剂	12.5×10 6个细胞/ml对照供体 12.5×10 6个细胞/ml竞争剂

加载0.2毫升到0.5毫升注射器。为每个组准备额外的注射器可能是谨慎的。有一个额外的可以帮助作为尾静脉注射可以是棘手的。
将0.2ml细胞混合物注入每个受体动物尾静脉（每组5只）对于尾静脉注射，使用红外灯将小鼠轻微加热，约束并将细胞注射到小鼠的尾静脉中。
受体小鼠应该是同类野生型C57BL6小鼠（CD45.2）
如上所述，这些动物需要在注射前24小时用9.5Gy的照射进行照射
注射后，使受体小鼠静止4-6周。一周后水应改为正常。

第二部分：血液重建分析
在骨髓移植后4-6周之间评估总供体重建的第一分析。我们通常在6周开始，监测重建，每两周一次，最多20周。

获得用于流式细胞术的总白细胞
1. 用红灯加热小鼠（小心不要过热小鼠）。
2. 将鼠标放在过滤器中。
3. 用锋利的手术刀切开尾静脉，收集200μl血液到正确标记的eppendorf管中（每只小鼠不要提取超过约200μl的血液）。
4. 确保在收集血液之前向每个eppendorf管中加入30μl的10,000 U/ml肝素溶液。这将防止血液凝结。
5. 对于实验的所有受体小鼠，保持相同。
6. 小心地为每个血液样品添加200μlPBS，如果eppendorf管脏了，改变它
7. 小心移液（非常缓慢）400微升ficoll到每个管的底部。两相应形成; 底部有聚蔗糖相，顶部有血液相
8. 在室温下以4,000×g离心管6分钟。
9. 小心地从离心机中取出试管; 骨髓单核细胞将在两个相之间形成细小的白色环，大约200μl体积。
10. 小心收集细胞的环用200微升移液器吸头到新的FACS微管
11. 如果需要额外的细胞染色（可选），将每个样品分成两个FACS微管。
12. 确保仔细标记FACS微管，以正确识别样品
13. 用冷的FACS缓冲液洗涤细胞一次：向每个管中加入1ml FACS缓冲液
14. 在4℃下将细胞离心200分钟，5分钟。
15. 使用真空小心地吸出上清液，细胞沉淀将很可能是不可见的，因此，吸出上清液留下底部足够的液体，不吸取所有的液体！

标记细胞用于流式细胞术

在FACS缓冲液（1:100）中稀释生物素抗小鼠CD45.1抗体; 计算所需样品数量的体积，通常制备过量（例如：对于20个样品，制备25x溶液 - 500μlFACS缓冲液和5μl抗体）。
重悬细胞在20微升的抗体溶液制备; 将抗体直接加入细胞。不要添加到管壁。
小心涡旋每个管以重悬细胞。
在冰上孵育10分钟。
向每个管中加入1ml FACS缓冲液
在4℃下将细胞离心200分钟，5分钟。
小心吸出上清液。

流式细胞术染色可以如下进行：

标签＃1：骨髓群体标记（20μl体积/管）	标签＃2：淋巴细胞群标记（20μl体积/管）
PE抗小鼠CD115抗体（1:250稀释） FITC抗小鼠Gr-1抗体（1:100稀释） APC抗小鼠Ter119抗体（稀释1:100）链霉亲和素PerCp	APC抗小鼠B220抗体（稀释1：400） PE抗小鼠CD3抗体（稀释1:200） FITC抗小鼠NK1.1抗体（稀释1:100）链霉亲和素PerCp

根据样品数量，为每次染色用FACS缓冲液制备储备溶液
用20μl抗体溶液直接重悬每个样品
小心涡旋每个管。
避光保护。
在冰上孵育10分钟。
向每个管中加入1ml FACS缓冲液
在4℃下离心细胞，200×g/g，5分钟。
小心吸出上清液。

流式细胞术
1. 在BD LSR II软件上，选择"新实验"进行设置。
2. 选择面积，高度，宽度的FSC和SSC; 为颜色FITC，PE，APC，PerCP选择日志和区域。
3. 创建补偿控制和调整未染色血细胞的门控（必要时调整FSC和SSC电压）。
4. 调整电压面板中单个污渍的每种颜色，使正峰位于10 ⁴标记处。
5. 对于单染色，对于PerCP使用抗CD45.1，对于APC使用抗B220，对于PE使用抗CD3，以及对FITC使用抗Gr-1。
6. 在对每个单个污渍进行任何调整后记录所需的电压，然后计算补偿控制
7. 活动现在已准备好记录 - 设置为收集5,000-10,000个活动。

第三部分：长期骨髓移植分析

通过CO 2安乐死或颈脱位移植后20周牺牲嵌合体。
使用镊子和锋利的剪刀提取后肢。将骨头放在冰上的PBS中。分离在6孔板的不同井中的单个骨。
为了能够正确识别骨骼，必须在6孔板中标记孔。
使用3ml注射器和21G×1.5针，用5ml冰冷PBS（每个样品15ml管）冲洗来自骨腔的总骨髓细胞。为了分离骨髓细胞，使用相同的注射器重悬5ml的细胞溶液
在室温下将细胞离心200分钟，5分钟。
将沉淀重悬在1ml RBC裂解缓冲液中。
在冰上孵育细胞1.5分钟。
每管加入10ml PBS。
在室温下将细胞离心200分钟，5分钟。
将细胞沉淀重悬在5ml PBS中
将5毫升细胞悬浮液通过50微米的尼龙过滤器，得到均匀的单细胞悬浮液
转移1毫升的每个样品到FACS管
确保仔细地标记FACS管，以正确识别样品
在4℃下将细胞离心200分钟，5分钟。
继续如前所述的流式细胞术染色

食谱

FACS缓冲区
0.5％胎牛血清（FCS）
2mM EDTA 0.05％叠氮化钠溶于无菌PBS中
过滤灭菌
RBC裂解缓冲液
0.15 M NH 4 Cl
1mM NaHCO 3/v/v 0.1mM EDTA溶于无菌双蒸水中用1M HCl将pH调节至7.2-7.4 过滤灭菌
肝素溶液
将100KU肝素钠盐溶于10ml无菌双蒸水中，得到10,000U/ml

致谢

该协议改编自以前发表的文章：Maryanovich等人（2012）。我们的研究部分由以色列科学基金会（ISF），美国 - 以色列二元科学基金会（BSF），德以色列基金会（GIF），Minerva基金会，MDM ICR研究奖和Milgrom奖支持。 A.G.是Armour家庭职业发展癌症研究主席的任职者。

参考文献

Maryanovich，M.，Oberkovitz，G.，Niv，H.，Vorobiyov，L.，Zaltsman，Y.，Brenner，O.，Lapidot，T.，Jung，S.and Gross，A。 ATM-BID途径调节造血干细胞的静止和存活。 Nat Cell Biol 14（5）：535-541。