材料和试剂

新西兰白色婴儿兔（2-5天龄）（Millbrook农场）
哺乳母鹿（Millbrook农场）
霍乱弧菌
注意：或者，可以成功地在婴儿的肠道系统中定殖的任何肠道致病菌可以用于该方案。
Zantac（GlaxoSmithKline，NDC：0173-0363-01）
40mEq/20ml氯化钾（KCl）（Hospira，NDC：0409-6653-05）
异氟烷（USP）（Piramal Enterprises，NDC：66794-013-25）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号：51225）
X-gal和/或抗生素（取决于实验菌株的选择标记）
70％乙醇
2.5％碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）（参见配方）
Luria-Bertani肉汤（LB）培养基和LB琼脂固体培养基（参见Recipes）

设备

BL2动物设施
通风橱
37°C培养箱或温室
1ml无菌注射器（BD，目录号：305553）
3ml无菌注射器（BD，目录号：DG508504）
26 G 5/8针（BD，目录号：305115）
外科剪刀和镊子（Fine Science Tools）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
1.5 ml无菌微量离心管
96孔组织培养板（BD，目录号：353072）
尺寸5法国导管
丝绸绑带
振动器
分光光度计
微珠打浆机-16（Bio Spec Products，目录号：607）

程序

检查他们到达当天的窝：2-5天龄的新西兰白兔和哺乳母鹿的獭从商业供应商获得并且在实验期间容纳在一起。一个最少六只兔子需要测定每个评估的菌株
接种制备：将来自每个突变体（lacZ +）和野生型（ lacZ - ）的新划线板的单个菌落在含有实验菌株在37℃下摇动约5至6小时。将细菌细胞沉淀（9,000rpm，5分钟），弃去上清液，将沉淀物重悬浮于无菌碳酸氢钠缓冲液中。将细菌的浓度调节至约2×10 9 cfu/ml。然后将野生型和突变体溶液混合在一起（1:1）
Zantac处理（接种前3小时）：称量婴儿兔，并使用26G针和1ml注射器通过腹膜内（i.p）注射（2mg/kg体重）施用Zantac。（已发现该剂量的抗酸治疗瞬时改变胃的pH，而不会在婴儿兔中引起不良反应。
在Zantac处理后3小时：使用具有柔性尖端的5号法国导管将婴儿兔子用0.5ml细菌口服接种。建议剂量为每90g兔体重1×10 9 cfu/ml。
输入比率测定：将接种物在1x PBS中连续稀释，并铺板在含有X-gal的LB琼脂上。在37℃过夜温育后计数白色和蓝色菌落的CFU。
清洁导管：依次用70％乙醇，H 2 O和1x PBS清洗导管。
监测兔子：监测婴儿兔的腹泻和疾病的征兆（例如脱水，低体温，瘙痒的毛皮，嗜睡和肌肉紧张），并在几天内常规安乐死。
安乐死：通过吸入异氟烷麻醉婴儿兔，并通过心内注射KCl（2mEq/ml，3ml）使其安乐死。
尸检：从十二指肠到直肠的整个肠道被去除。
1. 盲肠液：首先收集盲肠液（每只兔子1-2ml）用丝结扎将盲肠与肠的其余部分隔离; 然后，通过剪切盲肠的末端收集盲肠内容物并允许内容物在重力下排入收集管中。每只兔的1ml盲肠液用于CFU计数
2. 远端小肠和结肠：切下并取出1cm样品，然后在1ml 1x中匀浆（例如珠磨机或载玻片剪切） PBS。
输出比测定：将每个样品的系列稀释液接种在具有抗生素和X-gal的LB固体培养基中，并在37℃温育过夜以计算野生型和突变株的输出比。
竞争指数（C.I）计数：每个突变体的竞争指数定义为突变体/WT株的输入比除以突变体/WT株的输出比。（图1）

代表数据

婴儿兔竞争性指数计算示例

图1.兔子弧菌霍乱弧菌C6706株的肠道定植相关突变体的婴儿兔竞争测定。进行比较建群相关突变体与亲本菌株C6706IncZac（em） - （em）的体内竞争实验。左，阴性对照突变体C6706 lacZ + ;中左，严重定植缺陷突变体Δ tcpA 中间缺陷突变体ΔdncV和右，超定殖突变体ΔvspR。通过相对于C.I.的t检验确定统计学显着性。为C6706，lacZ + em/+与WT之间的竞争确定，其中****指示P值< 0.0001，*** P < 0.001。显示了SEM的平均值

笔记

伦理声明
所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南由哈佛医学院动物研究保护常设委员会批准的方案进行。哈佛医学院的动物管理计划也通过实验动物保护国际评估和认证协会（AAALAC国际）的认证。该机构还接受作为强制性的受惠者机构的PHS关于人道关怀和使用实验室动物政策以及NIH原则在用于测试，研究和培训中的脊椎动物的利用和护理。实验动物福利办公室（OLAW）已批准已批准的合规性保证（A3431-01）。

食谱

2.5％碳酸氢钠缓冲液（pH8.0）（100ml）将2.5g碳酸氢钠与80ml dH 2 O混合用NaOH将pH调至8.0 将dH <2> O添加到100 ml
过滤灭菌（0.2μm）
在室温下贮存
Luria-Bertani肉汤（LB）培养基（1L） 10g胰蛋白胨，10g NaCl和5g酵母提取物的混合物
将dH <2> O添加到1 L
对于LB琼脂，加入琼脂至最终浓度为1.5％
将混合物加热至沸腾以溶解琼脂并通过在15psi，121-124℃下高压灭菌15分钟来灭菌
在室温下贮存

致谢

该方案首先在我们以前的霍乱弧菌肠道定殖研究中被描述和使用（Fu等人，2013），并且改变自宝贵的婴儿兔模型，其是描述于Ritchie等人（2010）。我们感谢Waldor博士和Ritchie博士提供了有用的建议和意见。这项工作由授予AI-018045和AI-26289授予J.J.M.来自国家过敏和传染病研究所。

参考文献

Fu，Y.，Waldor，M.K.和Mekalanos，J.J。（2013）。霍乱弧菌肠道定殖的Tn-Seq分析揭示了T6SS的作用在宿主中介导的抗菌活性。 Cell Host Microbe 14（6）：652-663。
Ritchie，J.M.，Rui，H.，Bronson，R.T.and Waldor，M.K。（2010）。回到未来：使用婴儿兔子研究霍乱发病机制 MBio 1（1）。