材料和试剂

来自流感样疾病患者的呼吸道标本（喉拭子，痰和气管吸出物）
Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞（上海生物科学研究所）
Eagle的最低必需培养基（EMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11095-080）
胎牛血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：10099）
病毒运输培养基（Yocon Bio-technology，目录号：MT0301-1）
QIAsymphony Virus/Bacteria Mini Kit（QIAGEN，目录号：931036）
无核酸酶水（Life Technologies，目录号：10977）
SuperScript III Platinum SYBR Green一步法qRT-PCR试剂盒（Life Technologies，目录号：11736）

用于检测甲型流感H7N9病毒的引物序列

底漆 ^a	序列（5'-3'） ^b	PCR扩增子（bp）
H7F H7R N9F N9R	TGAAAATGGVTGGGAAGGYY TGCCGATTGRGTGCTYTTRT ACAGTGTACAAYAGCARRGT GTTTCGRGCCCAYGTRTTAA	103 165

F：Forward; R：反向
^b V：A/C/G; Y：C/T; R：A/G

设备

T-25细胞培养瓶（Corning，目录号：430168）
生物安全3实验室（BSL-3）（病毒分离所需）
QIAsymphony SP仪器（QIAGEN，目录号：9001297）
ABI Prism 7900HT序列检测系统（Life Technologies，Applied Biosystems ，目录号：4329001）

软件

序列检测系统软件（v2.3）（Life Technologies，Applied Biosystems ）

程序

病毒隔离
1. MDCK细胞在Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）在T-25细胞中含有10％热灭活的胎牛血清（FBS）并在37℃，在潮湿气氛下温育 5％CO <2>。
2. 分散呼吸道标本（咽喉拭子，痰和气管吸出物）维持在病毒运输中介质通过涡旋1分钟。痰用等体积预稀释的PBS溶液，然后进行涡旋程序
3. 当MDCK 细胞生长至85％汇合，0.5ml呼吸标本将H7N9病毒感染的阳性接种到细胞中
4. 每天通过显微镜观察细胞病变效应
5. 当90％的MDCK细胞经历细胞病变效应（图1）时，通过在2,000rpm离心收获细胞培养物上清液 10分钟，储存于-70℃直至使用
  
  图1.舍入感染的细胞，与相邻细胞融合以形成合胞体最终裂解，与未感染的细胞相比。 A：未感染细胞; B：具有细胞病变效应的细胞
6. 200微升细胞培养上清液进行RNA提取。纯化病毒核酸用作测定对照。
RNA提取
1. 从200μl的细胞培养上清液或提取病毒RNA 呼吸标本使用QIAsymphony Virus/Bacteria Mini Kit组合与QIAsymphony SP仪器，遵循制造商指令。
2. 提取的RNA用60μl洗脱无核酸酶水。通过琼脂糖凝胶分析RNA完整性电泳，然后储存在-70℃直至使用。
基于SYBR绿色的实时RT-PCR测定
1. 进行一步实时定量RT-PCR测定使用SuperScript分别扩增H7N9病毒的HA和NA基因 III铂金SYBR Green一步法qRT-PCR试剂盒。进行测定每个未知样品重复或重复三次。
2. 该测定在含有：
  的10μl反应混合物中进行 5μl2x SYBR Green Reaction Mix
  0.8μM的每条引物
  0.2μlROX参比染料（500nM）
  0.2μl的SuperScript III RT/Platinum 混合物
  1μl纯化的RNA xμl不含核酸酶的水
3. 优化的热循环条件如下：
  1. 在50℃下10分钟的逆转录步骤
  2. 在95℃5分钟的初始变性步骤
  3. 95个循环的PCR扩增15秒，60℃20秒，和72℃30秒，然后进行解链曲线分析程序根据仪器文档。
4. 最后，数据并使用Sequence分析结果检测系统软件v2.3。 H7和N9特异性的T m1值扩增子分别为80.77和81.20。

致谢

该实验方案部分改变自先前发表的论文：Zhu等人（2013）。该方案由江苏省科技教育健康发展项目（ZX201109），江苏省重点医学人才基金（JKRC2011002，RC2011191），江苏省科技支柱计划（BE2011796）部分支持。我们感谢中国北京疾病预防控制中心中国国家流感中心Shu Yuelong教授提供用于引物设计的前三个H7N9病毒分离株的全部基因序列数据。

参考

Zhu，Z.，Fan，H.，Qi，X.，Qi，Y.，Shi，Z.，Wang，H.，Cui，L.and Zhou，M.（2013）。基于SYBR Green的实时RT-PCR测定法的开发和评估，用于检测新出现的禽流感A（H7N9）birus。 PLoS One 8（11）：e80028。