图1。 A：纯化鞭毛（相差）; B：纯化鞭毛（TEM）; C：脱膜膜囊泡（TEM）。条= 500nm

材料和试剂

单元格
衣藻细胞可以从多种来源获得，并且纯菌株可以从衣藻资源中心获得（ http：//chlamycollection.org/contact-us/）。
培养基和细胞培养（见注释）
用于洗涤细胞的培养基（2-4L）
0.5 N乙酸
0.5 N KOH
蔗糖
Triton X-100或Nonidet P-40
纤毛洗涤缓冲液（CWB）（参见配方）

设备

Pellicon切向流微滤盒（Millipore， www.millipore.com ）
注意：可以使用450ml离心瓶和大转子收获细胞，但是对于8-16L细胞，收获更快，并且使用Pelicon进行更少的细胞絮凝。
带有用于450ml瓶和40ml管的转子的制备型离心机
450 ml离心瓶
40 ml离心管
12ml离心管
带有摆动斗式转子和角度转子的中速离心机
Fernbach烧瓶（2,800ml）或大烧瓶
超速离心机和转子
注意：对于750 ml，我使用Beckman 35或Ty45Ti转子和两个Beckman超速离心机。
相差显微镜
轨道振动器
明亮的荧光灯 - 通常为4-6 F20/40 PL/AQ灯
透射电子显微镜
磁力搅拌器
pH电极

程序

方法1.纯化ectosome
外膜体在孵育期间由鞭毛释放并且包含在纯化鞭毛上发现的大多数表面暴露的（生物素化的）蛋白质（Dentler，2013）。

使用Pellicon盒系统收获8-16升的细胞。如果需要，通过离心进一步浓缩细胞（1,500×g，4分钟）。
轻轻悬浮细胞沉淀在新鲜培养基中。
1. 为了避免絮凝细胞，通过温和的旋动或通过悬浮颗粒用大口径玻璃或塑料移液管搅拌。总数悬浮液体积取决于离心机的可用性。
2. 每个Beckman 35或45Ti转子可以容纳六个70毫升管，总共体积为490 ml /离心机，使细胞悬浮在总体积中 700-900ml的M培养基。如果有访问更大的容量离心机或附加离心机和转子，最好增加避免淹没的细胞体积。
3. 通过相检查细胞对比显微镜，以确保没有分裂细胞和那几乎100％的细胞完全鞭毛和活动。如果单元格生病或不完全鞭打，制剂将受到污染细胞碎片或释放的鞭毛，最好不要继续这些细胞。
孵育悬浮细胞在恒定光照6小时或更长时间。
1. 可以在1L瓶或罐中用烧结玻璃鼓泡器对小室充气使用轨道摇床在2,700ml Fernbach烧瓶中轻轻涡旋在明亮的荧光灯下。
在孵育期结束时，通过显微镜检查细胞以确保所有是完整的，鞭毛和运动。在孵育期结束时，通过离心1500×g，4分钟沉淀细胞。这可以在4℃或在室温（〜23℃），细胞孵育的温度下进行。
1. 小心倾析上清液（包含脱落的囊泡）以避免干扰细胞沉淀或从瓶中吸出上清液。
2. 通过相差显微镜检查上清液确保不存在鞭毛。如果存在鞭毛或细胞，在11,000×g离心上清液10分钟。细胞沉淀可以轻轻地悬浮在M培养基中并且絮凝以纯化鞭毛（见下文）。
通过将上清液离心分离60分钟，125,000×g，4℃来制备脱落的膜。
通过抽吸除去上清液。含囊泡的丸粒几乎是透明的，并且容易脱落。通常，存在包含细胞体或叶绿体的紧密绿色沉淀物，其被更多的上覆透明丸。尝试悬浮含膜透明材料而不干扰生球团矿。悬浮在小体积的CWB中，保持所有悬浮颗粒的组合体积小于2ml。
将悬浮的小球在含有25％蔗糖的〜8ml的CWB上并在摇摆转子中离心3,000×g，10分钟，4℃。
除去25％蔗糖/CWB上的层（含囊泡），并在46,000×g离心30分钟，4℃，以沉淀膜囊泡。将小丸悬浮在小体积的CWB中，并通过相差和通过负染和通过透射电子显微镜检查检查鞭毛或细胞体。

方法2.从分离的鞭毛中纯化囊泡

鞭毛净化 - pH休克
鞭毛可以使用地布卡因或pH休克分离，但我发现膜在pH震荡鞭毛中更完整。对于从各种生物体分离和分离纤毛和鞭毛的其它方法，参见Methods in Infect Cell Biology，Vol 47,1995。
1. 收获细胞使用pelicon收获机和离心（见并将细胞悬浮在新鲜M培养基中至终体积100-200 ml。用于分离释放的膜囊泡（上面）的细胞也可用于分离鞭毛。
2. 使用磁力搅拌器和校准pH电极，通过将pH降低至4.0来使鞭毛细胞生长滴加0.5N乙酸。不要将细胞置于pH 4下超过1-1.5分钟。通过滴加0.5N将pH升至7.0 KOH。对于100ml培养基中的细胞，使用约4.5ml的0.5N 乙酸和5.2ml的0.5M KOH。对于大多数用途，最好是监测pH变化，但对于微量滴定中的质量减少板，加入规定量的乙酸和KOH是有用的
3. 通过在1,100×g离心3分钟沉淀细胞。
4. 用大口径移液管吸出上清液（含鞭毛），并在含有25％蔗糖的CWB上铺层。
  1. 在2,500×g离心10分钟，4℃的摆动转子中。
  2. 鞭毛将在25％蔗糖以上的界面处聚集。
5. 吸出白鞭毛层，用CWB稀释，并以17,000×g /小时，20分钟，4℃沉淀鞭毛。
6. 使用大口径移液管悬挂鞭毛在CWB，以避免打破鞭毛和检查与相差显微镜以确保制备无细胞体或其他碎片。
对于去污剂溶解的膜+基质。
洗涤剂提取的纤毛和鞭毛溶解大多数，但不是所有的膜，但也释放可溶性睫状蛋白。如果Bonafide鞭毛跨膜蛋白在完整细胞上生物素化，可以被明确鉴定（参见参考文献7）。
1. 将鞭毛悬浮于CWB中，加入10％Triton X-100或Nonidet P-40至终浓度为1％，在4℃孵育10-20分钟。
2. 在27,000×g离心15分钟，4℃，沉淀洗涤剂不溶性轴突和去污剂不溶性膜。的溶解的膜和基质蛋白将在上清液中。
囊泡释放和纯化
膜囊泡的纯化应当确保所有的蛋白质和脂质是膜的组分，但不是可溶性鞭毛基质蛋白。然而，囊泡与可溶性鞭毛蛋白的污染是可能的，因为膜从鞭毛和囊泡释放，捕获鞭毛基质蛋白。另外，从轴突摩擦膜或冻融它们导致轴突微管的相当破坏和轴突组分的释放。洗涤剂提取可以在没有显着的轴突破裂的情况下进行这是用于纯化四膜虫睫状膜的方法的改进（Dentler，1980; Dentler，1995）。从纯化的鞭毛中释放膜的其它方法包括冻融和摩擦膜（Wang和Snell，2003; Huang等人，2007; Pasquale和Goodenough，1987; Iomini等人，，2006; Snell，1976）或用低浓度的去污剂处理（Witman等人，1972; Bloodgood和May，1982）。
1. 从纯化的鞭毛（上面）开始悬浮在CWB。
2. 通过用玻璃吸管剪切或通过涡旋搅动鞭毛 1分钟，在冰上孵育1分钟，再次涡旋。重复5-10次。
3. 通过相差显微镜检查以检测形成小膜囊泡（将显示为点）和无膜轴突（其将是薄的并且比完整纤毛更少的折射）。
4. 如果膜不容易释放，添加Nonidet P-40或Triton X-100，在涡旋期间最终浓度为0.01-0.02％
5. 在蔗糖梯度梯度上层剪切或涡旋鞭毛由在CWB中的1ml 20％蔗糖（w/v），1ml 30％蔗糖（w/v） CWB和1.2ml 40％蔗糖（w/v）的CWB溶液。
6. 离心机中摆动转子。以200,000×g，2小时和2小时离心样品从30％和40％蔗糖之间的界面收集膜层（Dentler，1995）。
  注意：或者，囊泡可以通过将剪切的鞭毛分层超过〜8ml从轴突分离 CWB与25％蔗糖并且以3,000×g离心10分钟，4℃ 对释放的膜（上）做。附着的轴突膜将在颗粒中。
7. 小心取出膜从界面，用冷CWB稀释，和颗粒囊泡在48,000×g离心1小时。
8. 暂停囊泡在少量的CWB并通过相差和/或负检查染色和透射电子显微镜以确保囊泡是完整的，并且不被细胞碎片或轴突。

笔记

关于媒体和细胞培养的注意事项
1. 您可以在 http://www.chlamy.org/media.html 上查看文化媒体食谱。我更喜欢在Sager和Granick minimal（M）培养基中培养细胞（ http://www.chlamy.org/SG.html ），但广泛使用TAP媒体（ http://www.chlamy.org/TAP.html ）。培养基制备和培养条件也在参考文献8和15中描述
2. 高压灭菌媒体在4 L Pyrex瓶中。充气电池与烧结玻璃过滤器和室内空气。文化在恒光或者，获得均匀细胞群，在M培养基中培养12 h 明/暗循环。
3. 对于大多数制备，我使用8-16升生长至〜5×10 5个细胞/ml的细胞。

食谱

纤毛洗涤缓冲液（CWB）
50mM Tris-HCl（pH7.4） 3mM MgSO 4 100mM EGTA（pH7.4） 250mM蔗糖

致谢

该协议改编自Dentler（2013）。

参考文献

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