材料和试剂

C。在液体培养基（50ml，例如Lee's培养基，37℃）中在长丝诱导条件下生长的表达或不表达功能性表位标记的转录因子的白色念珠菌菌株（Lee等人。，1075）]
37％甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
液氮
Dynabeads Pan Mouse IgG（5ml）（Life Technologies，目录号：11041）
适合的针对与TF [例如小鼠单克隆抗HA抗体，HA探针抗体（F-7），Santa Cruz，目录号：sc-7392]融合的表位标签的小鼠单克隆抗体
100mM苯甲基磺酰氟（PMSF）溶于异丙醇（100×储备液）中
无DNA酶的RNase A溶液（10mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：B4287）
蛋白酶K溶液（20mg/ml）（Life Technologies，目录号：AM2546）
糖原（20mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：FERR0561）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Sigma-Aldrich，目录号：P2069）
5 M NaCl溶液
70％，100％冷冻乙醇
ds-DNA测定试剂盒（Life Technologies，目录号：P11496）。
TruSeq DNA样品制备试剂盒v.2（Illumina，目录号：FC-121-2001，FC-121-2002）
TruSeq ^TM DNA样品制备指南v.2（Illumina，目录号：FC-930-1021）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
E-Gel ^？ iBase ^TM和E-Gel Safe Imager ^TM Combo Kit ：G6465）
2％E-Gel SizeSelect ^TM琼脂糖凝胶（Life Technologies，目录号：G6610-02）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
SDS（Sigma-aldrich，目录号：L3771）
2.5 M甘氨酸（参见配方）
10％SDS（见配方）
李的媒介（见配方）
TBS缓冲区（请参阅配方）
裂解缓冲液（见配方）
PBS/0.5％BSA（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）（参见Recipes）
TE解决方案（参见配方）
TE/SDS溶液（参见配方）

设备

15 ml，50ml Falcon管
机架，包括50-ml Falcon管架（Unwire试管架，用于30mm管;保持24）（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ，目录号：14-809-30）
VSR-50实验室平台摇杆（Pro Scientific，目录号：PSI-512000-00）或等同物
垃圾箱
1.5 ml螺旋盖管
0.5 ml PCR管
FastPrep -24仪器（MP Biomedicals，目录号：116004500）
显微镜（例如 Zeiss Axiostar Plus）
18 G×1/2英寸针（BD Biosciences，目录号：305196）
2ml Eppendorf锥形管（Eppendorf，目录号：022363352）
探针超声波仪（例如MSE Soniprep 150 Plus，指数微探针，端径3mm）[MSE（UK），目录号：38121-114A]
玻璃珠（直径0.5mm）（Bio Spec Products，目录号：11079105）
血液/化学混合器346（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-059-346）
DynaMag自旋磁体系统（Life Technologies，型号：123-20D）
荧光阅读器（例如Tecan Trading AG，Infinite ，型号：M200）
BioAnalyzer 2100（Agilent）
HiSeq 2000 sequencer（Illumina）

软件

Galaxy NGS数据分析软件（ https://main.g2.bx.psu.edu/ ）
ChIP-Seq（MACS）峰值寻找算法软件（ http://liulab.dfci.harvard.edu/MACS/）

程序

蛋白质-DNA交联
1. 开始标记和未标记（对照）的预培养。在10ml富含培养基（例如酵母蛋白胨右旋糖）中的白色念珠菌菌株 - 允许在30℃下在剧烈摇动（200rpm）下生长过夜
2. 将细胞稀释至在50ml中的600nm（OD 600nm）的光密度为0.4 的适当的细胞诱导液体培养基（例如Lee的培养基在37℃），并允许在剧烈振荡（200rpm）下生长，直到细胞达到OD 600nm = 1.0的等效值（或通常在4天内） h在Lee's培养基中37℃）。
3. 加入1.4ml 37％甲醛加入到50ml Falcon管中，并将培养物（48.6ml）转移到Falcon 管。拧紧盖子以防止泄漏含甲醛液体
4. 将猎鹰管放在合适的机架和胶带。将机架放在摇杆上并搅拌在室温下30分钟（使用VSR-50以45rpm搅拌）实验室平台摇杆）。
5. 加入2.5ml 2.5M甘氨酸以停止交联反应，并在摇动器上摇动孵育10分钟。
6. 将样品以3500rpm（2,465×g）离心5分钟。丢弃上清液（含有甲醛）在合适的废物容器中。用10ml TBS缓冲液洗涤细胞3次，通过搅拌，快速（1-2 min）以3500rpm（2,465×g）离心并重悬于10ml中 TBS缓冲液。
7. 将样品以3500rpm离心5分钟（2,465×g）并弃去上清液。使用剩余的液体，重悬细胞沉淀并转移到1.5ml螺旋盖管
8. 短暂离心样品并除去剩余的上清液。在液氮中快速冷冻样品。将管在-80°C储存，直到使用。
准备Dynabeads用于偶联到抗体（在冰上或在4℃室中工作）
1. 进行Dynabeads与用于免疫沉淀（IP）的抗体的偶联在用于制备提取物的预定日之前的一天。主要的涡旋珠子的储液以重悬珠子和每50μl珠子 IP。
  1. 将所需体积的珠子转移到15 ml Flacon管中（例如 6个样品，转移〜300μl）。
  2. 快速离心并除去上清液。
  3. 用5ml PBS/0.5％BSA洗涤珠子（制备新鲜溶液，例如在50ml PBS中的0.25g BSA）。
  4. 通常需要每个IP2μg抗体以偶联至珠粒稀释1/10。将珠子以适当体积重悬 PBS/0.5％BSA，并以1/10稀释度加入所需体积的抗体（例如，对于6个样品和0.2μg/μl的抗体储备溶液）将60μl抗体转移到600μl重悬于PBS/0.5％ BSA）。
  5. 在4℃下，在血液/化学混合器上孵育珠子抗体过夜
  6. 快速离心15毫升Falcon管。用珠子抗体洗涤 PBS/BSA 0.5％，并重悬于30μl裂解缓冲液/IP（对于6个样品，重悬于〜180μl裂解缓冲液中）。
制备总提取物和DNA剪切（在冰上或在4℃室中进行）
1. 解冻来自步骤8的细胞沉淀在冰上，并将其重悬在700微升的补充有蛋白酶抑制剂混合物和1mM的裂解缓冲液 PMSF（每次1x决赛）。
2. 加入相当于0.5ml PCR管的玻璃珠。
3. 使用FastPrep-24通过珠磨制备总细胞提取物仪器，6次运行1分钟，每次6.0m /秒，在冰上1分钟（这些设置导致菌丝细胞的有效破裂。）。
4. 通过在光学显微镜下检查5μlFastPrep处理的样品，确保有效的细胞破碎
5. 在包含总量的螺旋盖管的底部打孔提取+珠使用18 G x1½英寸针，并迅速将其放在清洁2ml锥形管。 1.5毫升螺旋盖管的底部携带珠+总提取物必须引入2毫升微管
6. 快速离心（纺丝脉冲从0到〜9,000 rpm）组装的管以收集来自1.5的总提取物螺旋盖管在2ml收集管中。确保没有剩余的细胞粘附在1.5ml螺旋盖管中的玻璃珠上
7. 重新悬浮收集细胞碎片+提取物在2毫升收集管，并转移到干净的1.5毫升微管。
8. 超声提取4次，在20秒的电源8（旋钮位置）对于21的输出信号幅度（微米，峰值到峰值）使用a 探头超声波仪。尝试平均得到约200到300 bp的DNA片段（图1）。
  
  图1.通过超声处理优化DNA剪切。在20天期间将来自步骤16的总提取物（约700μl）超声处理4次秒，在其间的冰上孵育1分钟。 4种不同的超声波处理电源设置[顶部; 1，旋钮位置2输出功率6（Micron，Peak to 峰）; 2，旋钮位置4输出功率10.5; 3，旋钮位置6输出功率15; 4，旋钮位置8输出功率21]进行测试以优化DNA 片段大小范围。条件4是最佳DNA片段大小范围用于高通量测序（〜100bp至最大500bp，最大平均大小约300 bp）DNA梯级大小显示在左侧（bp，碱基对）。
9. 离心经超声处理的样品在14,000rpm，在4℃下10分钟，并转移上清液（这是全细胞提取物，WCE）到干净的1.5ml微量管中。
染色质免疫沉淀（在冰上或在4℃室中进行）
1. 转移500微升的WCE到一个新的1.5毫升微管，并加入30微升与步骤B9f抗体耦合的Dynabeads。
2. 在4℃下，在血液学/化学混合器上旋转，将Dynabeads-抗体-WCE混合物孵育过夜。
洗涤和逆转交联
1. 在寒冷的房间（4°C），将样品放在DynaMag Spin磁铁上系统以允许Dynabeads与WCE分离。洗两次用1ml裂解缓冲液，用1ml裂解缓冲液补充两次 360mM NaCl，用1ml洗涤缓冲液洗涤两次，用1ml TE缓冲液洗涤一次。对于每个洗涤步骤，将管放在磁铁上，旋转磁铁+ 管5-6次以允许有效吸引珠，丢弃上清液，加入1ml各自的缓冲液，去除磁铁大力搅拌试管30-50次。
2. 在4℃下以4,000rpm离心2分钟，除去上清液
3. 加入100微升TE/SDS溶液到珠粒。轻轻涡旋（中速）重悬并在65℃温育过夜。漩涡1 分钟，然后在第二天早上再次涡旋。在65℃下再孵育30分钟，然后进行。
DNA纯化
1. 以中等速度再次涡旋，并在65℃孵育30分钟。
2. 在14,000rpm离心2分钟，并将上清液转移到新的1.5ml微量管
3. 加入295微升TE，3微升RNA酶A（10毫克/毫升的股票）和2 μl的糖原（来自20mg/ml的原液）。涡旋混合样品（400 μl终浓度）并在37℃孵育2小时。
4. 加入15μl的10％SDS和7.5μl的蛋白酶K溶液。轻轻涡旋并在37℃孵育2小时
5. 用400μl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）提取两次，通过涡旋1分钟并在14,000rpm下离心10分钟室内温度。将每个提取步骤的上清液转移到a 清洁1.5ml微管。
6. 加入16μl的5 M NaCl 从步骤F28提取的上清液（应该〜350μl）。然后加入Vortex 2.5体积的冷冻的乙醇（〜875μl）。在-20℃过夜贮存 ℃。
7. 在4℃下以14,000rpm离心40分钟。
8. 除去上清液，用1ml冷冻冷却的70％乙醇洗涤
9. 在合适体积的H 2 O（通常为50μl）中重悬沉淀物
10. 根据制造商的说明书，使用Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒定量IP DNA。
DNA文库生成和高通量测序
1. 使用10 ng的IP DNA进行文库生成。生成Illumina 库，使用TruSeq DNA样品制备试剂盒v.2 通过TruSeq DNA样品制备v.2指南。步骤包括（有一些修改）：
  1. 按照TruSeq DNA样品制备v.2指南（第43页）中的建议进行末端修复。
  2. 用QIAquick PCR纯化末端修复的DNA纯化试剂盒as 推荐由制造商，而不是使用Agencourt AMPure XP 珠子
  3. 3'DNA末端的腺苷酸化，如TruSeq DNA样品制备v.2指南（第47页）中推荐的。
  4. 按照TruSeq DNA样品制备v.2指南（第49页）中的建议连接索引适配器。
  5. 用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒按照推荐方法清洗制造商，而不是使用Agencourt AMPure XP珠
  6. 使用E-Gel ^® iBase ^TM和E-Gel ^® Safe Imager ^TM Combo Kit and E-Gel < sup>® SizeSelect ^TM琼脂糖凝胶，2％，按照制造商来纯化所需的文库片段，而不是使用 2％琼脂糖与SyBr Gold凝胶。在20分钟期间将样品在E凝胶上迁移推荐由Invitrogen。选择平均大小为〜300 bp的片段。
  7. 通过PCR扩增来富集DNA片段 10个循环，如TruSeq DNA样品制备v.2指南中推荐的（第58页）。
  8. 用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR 推荐由制造商，而不是使用Agencourt AMPure XP 珠子
  9. 验证库并通过加载执行质量控制并在具有高灵敏度的BioAnalyzer 2100装置上迁移DNA DNA芯片（图2）按照制造商的说明书和as 如TruSeq DNA样品制备v.2指南第62页所示。
    
    图纯化的Illumina适配器连接的DNA文库的质量控制使用BioAnalyzer 2100。代表性BioAnalyzer 2100迁移简介来自ChIP的Illumina高通量测序DNA文库测定（Library）。指示了Illumina适配器二聚体（衔接子二聚体）。 DNA片段大小显示在x轴[（bp），碱基对]和 DNA丰度在y轴[（FU），荧光单位]。
2. 将ChIP文库样品稀释至2 nM，变性DNA样品并上样用于单读的Illumina HiSeq 2000测序流通池通道（51 碱基对每读）高通量测序制造商的说明
3. 生成的读取文件（FASTQ）使用在线Galaxy NGS数据分析软件进行预处理（Blankenberg等人，2010; Giardine等人，2005）。步骤包括：
  1. 使用FastQC版本0.52对FASTQ文件进行质量控制分析在Galaxy的网络界面 - 继续剪辑适配器污染的序列，使用Clip版本1.0.1。
  2. 将生成的文件映射到 C。白色念珠菌组装21基因组（ http://www.candidagenome.org/download/chromosomal_feature_files/C_albicans_SC5314/）使用Bowtie算法（Galaxy：Click on NGS mapping> Map with Bowtie for Illumina 1.1.2版） - C的装配21。 albicans 基因组可以通过点击用户>自定义构建导入到Galaxy （Galaxy Web界面的顶部窗口）。映射将生成BAM 用于使用峰值发现算法处理的文件。
4. 继续使用基于模型的分析与生成的BAM文件进行峰值查找用于ChIP-Seq（MACS）峰值寻找算法软件和以下在两个相应的详细协议之一上找到的指令（Feng等人，2012; Feng等人，2011）。

食谱

2.5M甘氨酸将93.8g甘氨酸溶解在500ml H 2 O中
10％SDS
将10克SDS溶于100毫升H 2 O中
李氏中等（1升）
将5.0g的（NH 4）2 SO 4 SO 4/
0.2g MgSO 4 .7H 2 O 2 2.5克K 2 HPO 4
5.0g NaCl
12.5克D-葡萄糖 0.5克L-丙氨酸 1.3克L-亮氨酸 1.0g L-赖氨酸 0.1克L-甲硫氨酸 0.0714g L-鸟氨酸 0.5克L-苯丙氨酸 0.5克L-脯氨酸 0.5克L-苏氨酸 0.001克生物素
蒸馏水至1 L
将成分（除生物素之外）在110℃下高压灭菌20分钟
添加生物素
pH 6.8±0.05
5x TBS缓冲液（1 L）
100ml 1M Tris-HCl（pH7.5）（100mM终于5×） 150ml 5M NaCl（750mM NaCl，最终浓度为5×） H 2 O至1L（750ml）过滤灭菌
储存在4°C
1x裂解缓冲液（500 ml）
25ml 1M HEPES-KOH（pH7.5）（50mM终浓度，1x）
14ml 5M NaCl（140mM终浓度，1x）
1ml 500mM EDTA（1mM终浓度为1mM）
50ml 10％Triton X100（1％终浓度1％） 10ml 5％脱氧胆酸钠（0.1％终浓度，1x）
H 2 O至500ml（400ml）过滤灭菌
储存在4°C
1×PBS/0.5％BSA（对于50ml）制备1x PBS溶液
1L在1×：向〜800ml的H 2 O添加8g的NaCl，0.2g的KCl，1.44g的Na 2 HPO 4水溶液， 0.24g KH 2 PO 4和用磁力搅拌器搅拌。用HCl调节pH至7.4，用H 2 O至1L完全。在室温下贮存。
PBS/0.5％BSA的制备在50ml Falcon管中，将0.25g牛血清白蛋白加入50ml 1x PBS中。不要混合，简单地储存在4°C〜30分钟到1小时。
1x洗涤缓冲液（500 ml）
5ml的1M Tris-HCl（pH8.0）（最终浓度为10mM，1x）
25ml 5M LiCl（250mM终浓度为1x）
2.5ml 100％NP40（0.5％最终在1x）
25ml 10％脱氧胆酸钠（0.5％最终在1x） 1ml 500mM EDTA（1mM终浓度为1x）
H 2 O至500ml（441.5ml）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂
通过将一片溶解在2ml H 2 O中制备的25x储备溶液等分100μl在1.5 ml管
储存于-20°C
TE解决方案
10mM Tris（pH8.0） 1mM EDTA
TE/SDS溶液
10mM Tris（pH8.0） 1mM EDTA
1％十二烷基硫酸钠

致谢

该方案改编自Drouin& Robert«Genomic-wide Location analysis of Chromatin-associated Proteins by ChIP on CHIP：Controls Matter»available at：http://www.ircm.qc.ca/LARECHERCHE/axes/Biologie/Chromatine/Documents/ProtocoleIRCM_LevureYeast1.pdf和Znaidi 等（2013）。这项工作得到了来自欧洲委员会（FinSysB PITN-GA-2008-214004），Agence Nationale de la Recherche（KANJI，ANR-08-MIE-033-01）和BIOASTER-Sanofi-Alliance pour Sciences de la Vie et de laSanté（AVIESAN）联合项目Christophe d'Enfert博士。

参考文献

Blankenberg，D.，Von Kuster，G.，Coraor，N.，Ananda，G.，Lazarus，R.，Mangan，M.，Nekrutenko，A.and Taylor，J.（2010）。 Galaxy：基于网络的实验员基因组分析工具 Curr Protoc Mol Biol Chapter 19：Unit 19 10 11-21。
Feng，J.，Liu，T.and Zhang，Y.（2011）。使用MACS从ChIP-Seq数据中识别峰。 Curr Protoc Bioinformatics第 2章：第2章14.
Feng，J.，Liu，T.，Qin，B.，Zhang，Y.and Liu，X.S。（2012）。使用MACS识别ChIP-seq富集。 Nat Protoc 7（9）：1728-1740
Giardine，B.，Riemer，C.，Hardison，RC，Burhans，R.，Elnitski，L.，Shah，P.，Zhang，Y.，Blankenberg，D.，Albert，I.，Taylor，，W.，Kent，WJ和Nekrutenko，A。（2005）。 Galaxy：用于交互式大规模基因组分析的平台 Genome Res 15（10）：1451-1455
Lee，K.L.，Buckley，H.R。和Campbell，C.C。（1975）。一种氨基酸液体合成培养基，用于发展白色念珠菌的菌丝体和酵母形式/em>。 Sabouraudia 13（2）：148-153。
Znaidi，S.，Nesseir，A.，Chauvel，M.，Rossignol，T.and d'Enfert，C.（2013）。参与白色念珠菌的两种热休克因子型转录调节因子的综合功能描述形态发生和毒力。 PLoS Pathog 9（8）：e1003519。