x

材料和试剂

注意：根据机构的实务标准，所有使用现有Mtb的工作都必须在生物安全3级（BSL3）设施中执行

巨噬细胞，原代巨噬细胞，如C57BL/6骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）或巨噬细胞细胞系（如RAW264.7）
te：BMDM可以如所述分离（Banaiee等人2006; Nagabhushanam等人，2013）。 RAW264.7细胞可以从ATCC（ATCC，目录号：TIB-71）购买。
L929细胞（ATCC，目录号：CCL-1）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11965）
胎牛血清（FBS）（热灭活的）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10082147）
1 M HEPES溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：15630-056）
200mM L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030-081）
青霉素 - 链霉素溶液（10,000U/ml）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-023）
八孔Permanox室玻片（Thermo Fisher Scientific，Nunc Lab-Tek Chamber Slide，目录号：177445）
八孔腔盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Nunc Lab-Tek Chamber coverglass，目录号：155411）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
牛血清白蛋白（BSA）（级分V）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1600）
洗涤剂：皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036），Triton-X100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）和/或Tween-20（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP337）
检测宿主细胞标记的主要抗体
例如，可以用小鼠抗运铁蛋白受体（抗TfR）抗体（Life Technologies，Invitrogen，目录号：136800）标记回收内体和早期吞噬体。晚期内涵体和溶酶体用兔抗LAMP1抗体（Abcam，目录号：24170）染色。
注意：
1. 如果将Mtb感染的载玻片从BSL3中移出用于成像，则所选择的抗体需要在固定之后和如下文在步骤A11中所述的长期固定的灭菌方法下工作，注释a。一些市售抗体可能在长期固定后失去识别或弱识别其表位。
2. 在给予弗氏佐剂的动物中不产生多克隆抗体是至关重要的，因为那样它们将直接识别Mtb以及它们所产生的任何细胞标记。应测试所有抗体以验证它们不直接识别Mtb。
免疫荧光的第二抗体
第二抗体可针对不同物种和不同颜色获得，并且用户可根据所使用的一抗来选择。它们被多种物质吸附以在免疫染色期间使物种交叉反应性最小化。例如，将山羊抗小鼠Alexa 594（Life Technologies，Molecular Probes，目录号：A11032）和山羊抗兔Alexa 594（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：A11037）。
注意，Mtb显示自发荧光，当在405nm激发时在475nm处具有发射最大值，因此通过许多DAPI滤光片可视化（Patiño等人，2008）。因此，应选择在该范围内不发荧光的次级抗体。
Lysotracker Red DND-99（DMSO中的1mM储备液）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：L-7528）
注意：Lysotracker染料有不同的颜色，可根据颜色要求选择。
葡聚糖（TexasRed，10,000MW，赖氨酸可固定）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：D-1863）（在PBS中制备25mg/ml储备液，在-20℃ ）
注意：葡聚糖可以以不同的颜色和分子量获得，并且可以根据需要和实验的目标选择。
Vectashield封固剂（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
Middle brook 7H9肉汤（Difco，目录号：271310）
白蛋白 - 葡萄糖 - 过氧化氢酶（ADC）（BD，目录号：212352）
油酸 - 白蛋白 - 葡萄糖 - 过氧化氢酶（OADC）（BD，目录号：212351）
指甲油（透明）
浸没油（显微镜50CC浸渍油）（例如尼康公司，目录号：IB-MA-MXA20234）
4％多聚甲醛的PBS溶液（见配方）
DMEM完整媒体（见配方）
DMEM/L929完整媒体（见配方）
L细胞条件培养基（参见配方）
含有0.1％皂苷的PBS中的2％BSA（参见Recipes）
含有0.1％triton X-100的PBS（参见Recipes）中的2％BSA
7H9完整媒体（见配方）
固定剂（见配方）
阻塞溶液（参见配方）

设备

分光光度计（使用比色杯测量分支杆菌培养物在600nm波长下的OD 600光密度）
一次性1.5ml比色皿（Perfector Scientific，目录号：9003）
一次性无菌过滤系统（500ml，0.22μm孔径）（Corning，目录号：430758）
30ml方形培养基瓶（Thermo Fisher Scientific，Nalgene，目录号：NE/2019-0030）
50ml，15ml falcon管（带塞密封盖）（Corning，目录号：430052和430290）
盖玻片（22×50mm，厚度＃1，0.13-0.17mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-545C）
带有用于旋转细菌培养物的摆动转子的离心机（例如，Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R;具有SX4750转子的台式离心机）
注意：Mtb文化应根据机构实践标准在BSL3设施中处理。
37℃摇床培养箱，带有用于Mtb液体培养物的气溶胶密封装置
Beckman气雾罐用于在falcon管（例如Beckman Coulter，目录号：BK359232）中离心分枝杆菌培养物。
多孔板托架盖（例如 Beckman Coulter，更多在此链接上 https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=GX-BB-012 ）
37℃摇床培养箱，带有用于Mtb液体培养物的气溶胶密封装置
荧光显微镜[例如装备有60x的Nikon Eclipse TiE/B型; Plan-Apochromat，NA 1.4油浸物镜，Ti Z驱动，高分辨率单色电荷耦合器件（CCD）数码相机; 光度冷SNAP HQ2和适用于DAPI，FITC和TexasRed频道的滤镜集]

软件

尼康成像软件 - 元素高级研究（NIS-Elements AR）版本3.2软件与反褶积模块
Graph Pad Prism软件

程序

巨噬细胞感染
注意：
1. 所有使用Live Mtb设置感染（以下步骤A1和A3-11）都应在生物安全级别3（BSL3）工具中完成。
2. BCG和Msmeg文化应在BSL3设施之外，但在生物安全II级机柜或根据机构实践标准处理。
3. 应使用合适的气溶胶罐和多孔板盖或根据实践的制度标准，进行Mtb和BCG培养物（下面的步骤A4-6）和感染样品（下面的步骤A9）的离心。这些罐和具有盖的多孔板载体应当在离心期间打开用于在生物安全II级机柜中装载和卸载含有镰刀或感染板的Mtb/BCG培养物。
1. 从冷冻的细菌原种（从对数中期培养物制备，即在-80℃下在18％甘油中冷冻的OD 600在0.5至1.0单位之间的培养物）接种液体分枝杆菌在10ml的7H9完全培养基中的培养物在30ml方形培养基瓶中。酌情包括抗生素（例如，选择含有卡那霉素作为选择标记的GFP的质粒，包括5μg/ml的卡那霉素）。在37℃下，在90-110rpm下，在气溶胶容纳单元中振荡孵育。 Mtb和BCG在37℃下在7H9完全培养基中大约每20小时双重，所以培养物将需要少量（〜4-5）天达到对数中期。如果需要，可以将培养物稀释到新鲜培养基中（例如，如果使用的抗生素在培养过程中易于降解），则以适当的间隔稀释。 Msmeg大约每3小时翻倍，因此在早晨稀释过夜生长的培养物，以达到对数中期，在白天用于感染。时间将取决于特定的应变，条件和起始接种物
2. 在组织培养实验室的生物安全II级机柜中感染前一天应进行巨噬细胞的电镀。板细胞在250微升的DMEM或DMEM/L929完全培养基每孔在8井室幻灯片。 BMDM可以每孔1×10 5个细胞的密度接种。如果使用RAW264.6巨噬细胞细胞系，可以在DMEM完全培养基中以6×10 4个/孔的密度接种。将细胞孵育在37 ℃培养箱。在Mtb感染当天，将幻灯片转移到37 ℃培养箱中，在BSL3设备中具有5％CO 2气氛。
  注意，放置在24孔板中的盖玻片也可以用于对巨噬细胞进行电镀以用于感染。然而，8孔腔室玻片和盖玻片提供无菌和无RNA酶电镀条件，使用最少的试剂。此外，可以用最小孔至孔差异测试多种条件，如在感染之前可以敲低不同的宿主标志物以观察宿主蛋白在吞噬溶酶体运输中的作用或可以在相同载玻片的不同孔中感染多种细菌菌株。
3. 使用分光光度计在比色杯中测量1ml培养物的OD 600。如果需要稀释培养物，以便在巨噬细胞感染的当天使培养物的OD <600> 在0.5至1.0 OD 600之间。
4. 将培养物转移到15ml falcon管中，在室温下以1500×g离心5分钟。
5. 除去上清液并将沉淀重悬于5ml PBS中，并再次在室温下以1500×g离心5分钟。重复一次，以从7H9完全培养基中除去Tween 80
6. 将沉淀重悬于5ml用于RAW 264.7巨噬细胞的DMEM完全培养基和用于BMDM的DMEM/L929完全培养基中，并将其转移至50ml Falcon。在室温下以450rpm的低速旋转5分钟以通过造粒除去细菌团块。转移上清小心避免沉淀到新鲜的15毫升falcon管。上清液不含具有大量单细胞群体的分枝杆菌群，因此用于感染巨噬细胞。
  注意：在此步骤中通过沉淀去除〜90％的分枝杆菌是不寻常的。例如，如果在步骤A3中，10ml的Mtb培养物的OD 600为0.5，则预期低速旋转后的上清液具有OD 600至0.05， 0.1，取决于结块的程度。
7. 测定在步骤A6中收获的上清液的OD 600。将OD <600>转换为细菌数。该值将根据细菌的形状，大小和内部光吸收组分而变化，并且对于相同物种的不同菌株可以是不同的。应该预先确定转换因子。例如，可以如下确定转化因子如OD 600 = 1.0 = 500×10 6个集落形成单位（CFU）/ml。
  1. 一个。将"x"OD 600的起始培养物连续稀释，并将每种稀释液的体积接种以得到CFU。
  2. 给出在可数范围内的菌落的稀释度和该稀释度的菌落数用于使用下式计算"y"CFU/ml：
    CFU/ml =（＃菌落）*（稀释因子）/（以ml计的铺板体积）
  3. 这给出x OD 600 = y CFU/ml。现在OD 600为1 = y/x CFU/ml。
8. 计算以约1-10的感染复数（MOI）感染巨噬细胞所需的步骤A6中制备的细菌悬浮液的体积。将该体积添加到每个孔中。如有必要，进行稀释，使至少10-50μl添加到每个孔中，总体积为200μl。应测试几个MOI，最佳MOI将取决于实验条件的细节。
9. 在室温下将载玻片在50×g下旋转2分钟，以使用具有在摇摆转子中的盖子的多孔板载体来同步感染。在37中孵育℃培养箱中，具有5％CO 2气氛。可以在较短的时间段后进行该步骤，虽然细菌摄取将较低
10. 在所需的时间点[例如感染后3小时（hpi），12hpi和24hpi]除去培养基。固定在1％PFA/PBS在4℃过夜的Mtb感染的样本或根据研究所的生物安全指南，之前从BSL3删除。在室温下在4％PFA/PBS中固定15分钟，用于Msmeg和BCG感染的样品。
  注意：
  1. 根据生物安全规则，Mtb感染的载玻片应该在从BSL3中取出用于免疫染色和成像之前进行灭菌（Schwebach等人，2001）。这可以通过长固定法实现; 在1％PFA/PBS中固定，在4℃下或根据机构的实践标准过夜（至少12小时）。
  2. 对于替代性固定剂，如甲醇或丙酮，镀敷巨噬细胞和感染的皿应与有机溶剂相容。
免疫荧光显微镜的染色
对于免疫荧光（IF）显微镜，必须预优化用于免疫染色的条件，其包括固定剂（参见步骤A11，注释ab），透过细胞的去污剂（triton X-100，皂苷或吐温-20）（Goldenthal等人，1985），对于每个第一抗体进行共定位实验。在标准化过程中，免疫染色的特异性可以通过RNA干扰（RNAi）沉默宿主标志物来证实。重要的是包括将有助于设置获取曝光的对照，并且还在荧光显微镜下用作非特异性染色的对照，如在步骤C21中进一步解释的。对于Mtb感染的样品，应筛选特异性宿主标志物的一级抗体以识别特异性表位，以获得巨噬细胞的最佳灵敏度，该巨噬细胞长期固定以灭菌Mtb，这与短期固定的BCG和Msmeg感染样品相反如协议步骤A11中所述）。
1. 用300μlPBS洗涤固定液3次。
2. 封闭：在室温下在封闭缓冲液中孵育1小时。例如，封闭缓冲液可以是含有针对一级抗体优化的0.1％去污剂的PBS中的2％BSA。洗涤剂渗透质膜，使抗体可以进入细胞，BSA阻断以防止非特异性染色。
  对于材料和试剂，转铁蛋白受体（TfR）和LAMP1中提及的市售一抗，分别加入200μl在PBS-0.1％triton X-100中的2％BSA和在PBS-0.1％皂苷中的2％BSA，相应的井被堵。
3. 一级抗体：向孔中加入150μl稀释的一级抗体，并在4℃下孵育过夜。在标准化的PBS-0.1％洗涤剂中的2％BSA中稀释一抗。对于主要抗体在材料和方法中提及的，在PBS-0.1％triton X-100和2％BSA的PBS-0.1％皂苷中的2％BSA中稀释TfR（1:250v/v）和LAMP1（1：1,000v/，
4. 用PBS-0.1％洗涤剂洗涤三次，每次在室温下洗涤5分钟以除去过量的和非特异性结合的抗体，例如使用PBS -0.1％triton X-100转铁蛋白受体和PBS- 0.1％皂苷用于步骤B14中使用的LAMP1抗体
5. 二抗：根据产生一抗的物种，使用用适当的荧光团标记的适当的抗物种（小鼠或兔）二抗。加入150微升稀释的第二抗体，并在室温下在黑暗中孵育1小时，以防止荧光团漂白。在PBS-0.1％洗涤剂中的2％BSA中稀释第二抗体1:250，例如使用在PBS-0.1％triton X-100中的2％BSA中的抗小鼠Alexa 594来检测抗TfR和稀释的抗兔Alexa 594在含2％BSA的PBS-0.1％皂苷中以检测抗LAMP1。
6. 重复步骤B15。防止光照，防止二抗的光漂白
7. 轻轻向上按压，从滑块顶部取出腔室，剥离橡胶垫圈（见图1）
8. 在载玻片上的8个孔中的每一个的中心放置〜2μl的抗褪色。安装一个干净的矩形盖玻片，并用指甲油密封盖玻片的侧面
9. 虽然这里没有详细描述，但是可选地，也可以使用lysotracker染料进行溶酶体的活细胞染色或用荧光葡聚糖（例如，TexasRed-葡聚糖）加载它们。活染色的动力学主要有两个变量，浓度和时间，并且根据期望的目标，可以最好地设计实验以将其与感染耦合。提供了对其使用的简要理解：
  1. Lysotracker是一种细胞可渗透的酸性营养染色，可用于标记巨噬细胞中的溶酶体，而不需要固定。染色条件不同，用户可根据实际实验标准化染料浓度和染色时间（30分钟至2小时）。
    1. 平板巨噬细胞和感染他们，如A部分所述。在感染巨噬细胞后所需时间点的最后30分钟，从孔中移除培养基，每孔加入150μl200nM lysotracker，并在37℃孵育。以后保护样品免受光漂白。在处理染色样品时关闭生物安全柜中的灯，以防止光漂白
    2. 用PBS洗涤孔三次，以除去过量的lysotracker。
    3. 添加PBS，并迅速进行图像采集用荧光显微镜。在无染料培养基中进一步孵育通常导致信号衰退和细胞起泡。
      注意：可以直接采集Msmeg和BCG感染的巨噬细胞样品用于实时图像采集，因此在这种情况下的巨噬细胞应该被镀在8孔室盖玻片上而不是载玻片上，使得室不必被去除。在Mtb感染的巨噬细胞的情况下，在用lysotracker进行活标记后，样品应当在从BSL3中成像之前根据研究所的生物安全指南进行固定。然后可以用PBS洗涤以除去固定剂，并用抗褪色剂装上。
  2. 德克萨斯州葡聚糖（10kD）对细胞的内吞和溶酶体囊泡网络是可自由渗透的，因此可以通过预加载巨噬细胞用于在感染之前标记溶酶体：
    1. 如步骤A2中那样铺板巨噬细胞。从孔中取出电镀培养基，并用150μl的1mg/ml葡聚糖溶液（稀释在PBS中）在37℃处理1小时，通过流体相内吞作用细胞摄取。
    2. 用预温的完全DMEM或DMEM/L929完全培养基（根据需要）洗涤两次，在显微镜下观察，如果需要，用预热的PBS洗涤两次。
    3. 加回温的完全DMEM或DMEM/L929完全培养基（根据需要），并在具有5％CO 2的37℃培养箱中孵育4小时，以将德克萨斯葡聚糖追加到溶酶体中。这一追逐期可以在隔夜进行，然后第二天感染。
    4. 感染巨噬细胞，并在感染后的所需时间点固定样品
图像采集
注意：根据个体或核心设施指南，在操作任何荧光或共聚焦显微镜进行图像采集之前，应先进行适当的训练。
1. 对于图像采集（有关更多详细信息，请参阅参考文献8），请务必使用以下控件：
  1. 固定但未染色作为细胞和细菌的背景自身荧光的控制
  2. 二次单独控制以检查非特异性染色
  3. 在多色标记实验的情况下的单色控制例如当在相同的孔中用相容的染色程序进行两种不同标记的双重免疫标记时。这对于以与用于获取多色样品的图像完全相同的设置收集所有通道中的每种单一颜色的图像是必要的。它有助于校正串扰（一种染料对于其他染料的入射光的激发）和渗透（一种染料向其他染料的检测器中的发射）。
  4. 如果单色控制指示渗透，最好在每个孔中仅进行一种标记物的免疫标记。
2. 使用Nikon Eclipse TiE/B显微镜，使用60×1.4NA油浸物镜在高放大率下使用专门用于荧光或共聚焦显微镜的说明来获取图像。设置微分干涉对比度（DIC）和所需颜色通道（DAPI，GFP和/或TxRed）的最佳曝光级别，但不会饱和像素强度。使用具有单色控制的自动曝光工具在估计曝光水平以防止串扰方面非常有用。
3. 吞噬后，具有细长杆状形态的分枝杆菌主要定位在细胞的细胞质中的囊泡结构/吞噬体中长达48小时（van der Wel等人，2007）。分枝杆菌的宽度为0.2至0.5μM，平均宽度为0.35μM，因此应当获得合适的z-堆叠。通常应该每孔获得至少三个具有10至15个巨噬细胞的场，以产生每个条件最少100个感兴趣区域（ROI），用于计算统计显着性。注意：当在DAPI通道中使用Mtb的自发荧光来显现细菌时，建议将样品对于405nm处的激发入射光的暴露保持为最小，因为它快速漂白Mtb的自发荧光。< em>
4. 如果需要，在使用Nikon Eclipse TiE/B落射荧光显微镜的情况下解卷积图像，并在分析前校正所有图像上的背景。
图像分析
内体/溶酶体标记定位在吞噬体货物周围（Fratti等人，2001; Hava等人，2008; Delaby等人， 2012; Mottola 。，2014）。在图2A所示的实施例中，宿主标记物，运铁蛋白受体（TfR）以灰色显示，吞噬体货物Mtb以绿色显示。这里，宿主标记和细菌/细菌簇的共定位的程度在吞噬体之间是可变的（参见图2A中的吞噬体1,2,3和4）。定性分析目视观察吞噬体，2和3具有高和吞噬体，1和4具有围绕细菌的低TfR染色。对于围绕细菌/细菌簇的宿主液泡染色的定量，我描述了使用NIS-Elements AR版本3.2使用图2作为实例进行的自动化分析。
1. 在细菌的颜色通道中创建二进制图像（绿色）。在二进制图像中，背景将具有0像素强度，并且所选择的对象（细菌）将具有1的像素强度。在给定的示例中，图2B，这可以通过"阈值化"菌。此外，在NIS Elements高级研究软件中，可以使用"自动检测所有"工具，通过检测光标下的像素强度来工作，因此光标移动有助于标记给定字段中的所有细菌。
2. 使用细菌的二进制图像，"扩张"三次放大活动窗口中的标记细菌。将此图像与扩张的细菌复制到剪贴板，这是一个参考二进制图像，以供以后使用（图2C）。
3. 现在使用扩张的细菌图像的活动窗口，在步骤D26中，"Erode"三次缩小放大的区域。这将创建一个当前的二进制图像，以供以后使用（图2D）。
4. 在两个图像（图2E）上使用命令"eXclusive OR"（XOR）函数，分别从步骤D26-27获得参考和当前二进制，以产生处理结果二进制图像，其中在细菌/细菌簇周围标记"环" （图2F）。
5. 在活动结果二进制图像中，将环转换为感兴趣区域（ROI）（参见图2G中的ROI ID：1-4）。
6. 打开液泡标记的图像（例如 TfR），并测量该通道中的ROI以获得ROI的平均荧光强度（MFI）（参见图2H）。
  注意：
  1. 分析的验证：图2A中吞噬体2和3上的高共定位和吞噬体1和4上的较低共定位的视觉评分与图2H中的自动化定量相关，具有ROI ID：2，具有最大平均强度和ROI ID ：1具有最小的荧光强度。
  2. 对于每个吞噬体货物，对于扩增和侵蚀的计数数目应该由个体用户在一组图像上最佳地确定，以最佳地捕获液泡标记物的信号强度。
7. 为每个井在Y轴上绘制所有ROI的MFI。图形显示，统计计算和P值可以使用Graph Pad Prism软件确定注意：
  1. 形状算子（膨胀，腐蚀）和布尔逻辑运算被集成为许多图像分析软件中的处理工具，以便于使用。然而，它们基于复杂的数学理论，因此我参考文献（Serra，1987; Dougherty和Lotufo，2003），要小心这些处理参数的解释。
  2. 个体用户应该优化对具有吞噬体货物的不同宿主标志物的共定位的自动化分析，并且使用视觉评分对结果进行计数，以如上述方案D节中所述验证分析。
  3. 自动分析贩运实验的结果（例如，在Mtb感染的巨噬细胞中，Mtb与TfR和LAMP1在3和24hpi处的共定位）应当与由盲目观察者手动进行的视觉评分一致。
  图1.显示顶部腔室与8腔室腔室滑动的示意图
  从孔中取出洗涤缓冲液（A），如图所示插入刀片（B），并施加温和向上的压力，这将分离顶部塑料腔（C），露出橡胶垫圈（D）。轻轻剥离橡胶垫圈（E）。
  
  图2.主机标记物与分枝杆菌吞噬体的共定位的自动分析 A.在24hpi下Mtb感染的RAW 264.7巨噬细胞的免疫染色图像。 A：灰色的宿主标记（TfR）和绿色中的Mtb共定位在吞噬体1,2,3,4（由蓝色箭头指示）上至不同程度。图像已被伪彩色的插图。 B-H：如协议部分D的步骤25至30中所述的量化协同定位的二进制图像处理：这里，黑色，灰色和黄色圆圈分别是图像C，D和F的符号表示。 E显示布尔（XOR）算子对图像C和D图像的影响的图示，以产生F.H给出了ID为1至4的不同ROI中TfR的平均荧光强度（MFI）的定量。

食谱

4％PBS中的多聚甲醛溶液（pH7.4）（1L）

多聚甲醛
40克

10x PBS
100 ml

去离子水
800 ml

注意：多聚甲醛烟雾是有毒的。所有工作都应在通风柜中进行。
1. 在热板上将800ml加热至60℃
2. 在热板上搅拌的同时加入40g多聚甲醛
3. 加入50μl10N氢氧化钠（NaOH），继续搅拌
4. 让溶液搅拌直到多聚甲醛溶解。
5. 加入25ml 10x PBS并混合
6. 使用适当的pH条测量溶液的pH
7. 加水至1升的最终体积。
8. 通过0.45μm过滤器过滤4％多聚甲醛
9. 等分并在-20°C下冷冻，长期储存。
DMEM完整媒体

DMEM
435 ml

1 M HEPES
10 ml

0.2 M L-谷氨酰胺 5 ml

热灭活胎牛血清50ml
通过0.2μM过滤器过滤灭菌并在4℃下贮存如果要用于感染，媒体中不应包括抗生素

DMEM/L929完整媒体

DMEM	390 ml
热灭活FBS	50 ml
L929细胞条件培养基	50 ml
0.2 M L-谷氨酰胺	5 ml
0.1M丙酮酸钠	5毫升

通过0.2μM过滤器过滤灭菌并在4℃下贮存如果要用于感染，媒体中不应包括抗生素。

制备L细胞条件培养基
L929细胞培养基

DMEM	440 ml
热灭活FBS	50 ml
200mM L谷氨酰胺	5 ml
100x非必需氨基酸	5 ml
1,000xβ-巯基乙醇	0.5 ml

解冻1小瓶的L929细胞，添加1毫升温暖的媒体到小瓶和板在一个15厘米的TC菜至少35毫升温暖的媒体。
允许成长到汇合，从冷冻股票开始通常需要3-4天
用1×PBS冲洗细胞，然后用10ml 1x胰蛋白酶EDTA覆盖并在37℃℃ 1-5分钟，直到细胞以轻轻的移液从板的底部离开。
向细胞中加入过量的L细胞培养基（3倍体积的胰蛋白酶EDTA加入），并上下吸取以破碎团块。
以650xg离心5分钟。
将细胞重悬于25 ml培养基中。
将1ml细胞加入含有38ml生长培养基的15cm TC培养皿中的25个培养皿中
允许细胞生长约5-7天，细胞应在第6天达到汇合。吸出培养基并用0.22μM过滤器过滤。
等分到50毫升的小瓶，并冻结在-80 °C 长达六个月。

2％BSA的含有0.1％皂苷的PBS（50ml）
1. 称取0.1g皂苷，溶于100ml 1×PBS中。过滤0.45μm并在室温下储存
2. 轻轻地溶解2g BSA在50ml PBS-0.1％皂苷中（新鲜制备）。
含有0.1％triton X-100（50ml）的2％BSA，
1. 称取0.1g的triton X-100（w/v），并溶解在100ml的1×PBS中。过滤0.45μm并在室温下储存
2. 轻轻地溶解2 g BSA在50 ml PBS-0.1％triton X-100（新鲜制备）。
7H9完全培养基（1L）

7H9粉
4.7克

50％甘油 4.0 ml

20％吐温80
2.5 ml

水
到900ml
1. 将7H9粉末溶解在水中，加入甘油和吐温80.
2. 调节水的体积，使最终体积为900ml的介质。
3. 向Mtb完全培养基中加入100 ml OADC或者为Msmeg和BCG完全培养基加入100 ml ADC。
4. 通过0.22μM过滤器灭菌并在4°C下储存。
5. 或者，在将7H9和甘油溶解在约900ml水中后，高压釜，然后补充吐温-80和100ml ADC/OADC的无菌溶液，并储存在4℃。
固定剂
4％PFA/PBS用于固定BCG和Msmeg<
1％PFA/PBS用于固定Mtb
封锁解决方案
含有0.1％洗涤剂的PBS中的2％BSA

致谢

我感谢Jennifer A. Philips对本协议的监督和开发。该协议改编自公开的工作Mehra等人（2013）。这项工作得到了NIH（R01 AI087682），Doris Duke慈善基金会，美国传染病学会，Michael Saperstein医学学者研究基金（纽约大学医学院），Potts纪念基金会和美国微生物学会。

参考文献

Banaiee，N.，Jacobs，W.R.，Jr.and Ernst，J.D。（2006）。在小鼠肺和巨噬细胞中调节结核分枝杆菌 whiB3。 a> Infect Immun 74（11）：6449-6457。
Delaby，C.，Rondeau，C.，Pouzet，C.，Willemetz，A.，Pilard，N.，Desjardins，M.and Canonne-Hergaux，F。铁和血红素代谢相关蛋白在红细胞生成早期阶段的亚细胞定位。 PLoS One 7（7）：e42199。
Deretic，V。和Fratti，R.A。（1999）。结核分枝杆菌吞噬体 Mol Microbiol 31（6）：1603-1609。
Dougherty，E.R。和Lotufo，R.A。（2003）。实践形态学图像处理。 Spie Bellingham，WA。
Fratti，R.A.，Backer，J.M.，Gruenberg，J.，Corvera，S.and Deretic，V。（2001）。磷脂酰肌醇3-激酶和Rab5效应子在吞噬体中的作用生物发生和分枝杆菌吞噬体成熟停滞。细胞生物学154（3）：631-644。
Goldenthal，K.L.，Hedman，K.，Chen，J.W.，August，J.T.and Willingham，M.C。（1985）。免疫荧光的后固定洗涤剂处理抑制一些内在膜蛋白的定位。 J Histochem Cytochem 33（8）：813-820
Hava，DL，van der Wel，N.，Cohen，N.，Dascher，CC，Houben，D.，León，L.，Agarwal，S.，Sugita，M.，van Zon，M.and Kent，SC 2008）。通过病原体诱导的树突细胞成熟逃避肽，但不是脂质抗原呈递。/a> Proc Natl Acad Sci USA 105（32）：11281-11286。
Mehra，A.，Zahra，A.，Thompson，V.，Sirisaengtaksin，N.，Wells，A.，Porto，M.，Koster，S.，Penberthy，K.，Kubota，Y.，Dricot， Rogan，D.，Vidal，M.，Hill，DE，Bean，AJ和Philips，JA（2013）。结核分枝杆菌型VII分泌的效应物EsxH靶向主体ESCRT以损害运输。 PLoS Pathog 9（10）：e1003734。
Mottola，G.，Boucherit，N.，Trouplin，V.，Oury Barry，A.，Soubeyran，P.，Mege，J.L.and Ghigo，E.（2014）。属于鞭毛病的代理人的 Tropheryma whipplei 会影响早期到晚期吞噬体转换，并在Rab5和Rab7阳性区中存活。 9（2）：e89367。
Nagabhushanam，V.，Solache，A.，Ting，L.M.，Escaron，C.J.，Zhang，J.Y.and Ernst，J.D。（2003）。先天性抑制适应性免疫：结核分枝杆菌诱导的IL-6抑制巨噬细胞对IFN-γ的反应。"免疫学杂志"171（9）：4750-4757。
Patiño，S.，Alamo，L.，Cimino，M.，Casart，Y.，Bartoli，F.，García，M.J.and Salazar，L。（2008）。分枝杆菌的自体荧光作为检测结核分枝杆菌的工具。 J Clinical Microbiol 46（10）：3296-3302。
Schwebach，J.R.，Jacobs，W.R.，Jr.and Casadevall，A.（2001）。通过抗菌固定在生物安全3级杀灭结核分枝杆菌Erbman样品实验室。 J Clin Microbiol 39（2）：769-771
Serra，J。（1987）。形态光学。 145（第1篇）：1-22。
van der Wel，N.，Hava，D.，Houben，D.，Fluitsma，D.，van Zon，M.，Pierson，J.，Brenner，M.and Peters，P.J。（2007）。肺结核和麻风分支杆菌从吞噬溶酶体转移到骨髓细胞中的细胞溶质。 129（7）：1287-1298。
Waters，J.C。（2009）。定量荧光显微镜的精度和准确度。细胞生物学 > 185（7）：1135-1148。