材料和试剂

耻垢分枝杆菌 mc ² 155或结核分枝杆菌 H37Rv
Middlebrook 7H9肉汤（BD Biosciences，目录号：271310）
Middlebrook 7H11琼脂（BD Biosciences，目录号：283810）
Middlebrook OADC（BD Biosciences，目录号：212351）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
吐温80（Sigma-Aldrich，目录号：P1754）
利福平（Sigma-Aldrich，目录号：R3501）
7H9培养基（见配方）
7H9OADC介质（参见配方）
7H11琼脂（见Recipes）
7H11OADC琼脂（见配方）
LBG琼脂（见配方）
PBST（参见配方）
TE缓冲区（参见配方）

设备

孵育振动器
离心机
37℃孵育器
100 ml烧瓶
无菌玻璃珠
96孔平底板
胶粘剂
96孔PCR板
PCR仪
培养皿（直径70mm）

软件

BLAST或ClustalW

程序

利福平耐药突变频率的测定
1. 条纹在7H11琼脂平板上的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）培养物（不是含有利福平）并在37℃下培养3天直到菌落为止可见。
  对于Mtb，将其在7H11OADC琼脂平板上划线，并在37℃下培养4周
2. 接种单菌落在5ml 7H9培养基（对于Mtb，使用7H9OADC 培养基），并在37℃下振荡（150rpm）生长直至培养物饱和（OD 600〜2.0）。
3. 将培养物继代培养（1％v/v 接种）到20ml 7H9培养基（对于Mtb，使用7H9OADC培养基）中并在37℃下振荡生长至指数期（OD <600> = 0.4〜0.5）。
  注意：在该生长阶段的培养可用于应激诱导，例如氧化应激（H 2 ₂ 治疗）或饥饿。
4. 对于CFU测定，将培养物连续稀释1：100,000in PBST。将50μl的10 -5稀释液涂布在LBG琼脂板（用于Mtb，使用7H11OADC琼脂板）。在37℃下孵育平板4天。 CFU/ml =（每个平板上的菌落数）×2×10 6 。注意：每个样品至少需要三次稀释。
5. 将3ml来自步骤3的细胞培养物在3,000xg离心5分钟 min，将细胞沉淀重悬于100μlPBST（杆菌可以在没有吐温80的液体中形成团块。分离利福平抗性突变体，重悬的颗粒被扩散无菌玻璃珠在含有250μg/ml利福平的LBG琼脂平板上并在37℃下孵育4天。
  对于Mtb，重悬细胞将沉淀铺在含有10μg/ml利福平的7H11OADC琼脂平板上并在37℃下孵育4周。
  注意：玻璃或金属吊具是不推荐在此步骤中，因为分枝杆菌细胞可能吸附并在电镀期间聚集在铺展器上，这可能影响结果的准确性。
6. 自发性利福平耐药突变频率是通过除以数目来计算的每个板上的利福平抗性集落由总活细胞每板数（图1）。
  
  图1. MazG的antimutator角色 Msm（A）和Mtb（B）。赋予抗性的频率利福平在野生型（wt），mazG -null（ΔmazG）和补充在指数期（OD 600〜0.5）中测定突变（compl）菌株，有或没有氧化应激和在静止生长期。通过用处理指数期培养物诱导氧化应激（Msm）或24小时（Mtb）的10mM H 2 O 2 O 2。固定相位于分别为Msm或Mtb的培养的第5天或第28天。号码显示为平均值±S.E。的3个独立实验，共15个 Msm的培养物和Mtb的6。
突变谱分析
1. 将单个利福平抗性Msm菌落接种到1ml 7H9中在96孔平底板中含有100μg/ml利福平的培养基。然后将板用粘性膜密封并在37℃下温育 7天。注意，每个细菌至少需要30个菌落具有统计显着性结果的样本为了接种利福平抗性Mtb菌落，使用7H9OADC与4μg/ml利福平，在37℃孵育3周。
2. 然后将细胞沉淀（4,000×g，5分钟），并悬浮于50μlTE中缓冲液，将细胞悬浮液转移到96孔PCR板中
3. 将板在PCR仪中在95℃加热20分钟
4. 然后将PCR板在12,000×g离心5分钟，将上清液转移至新的96孔PCR板。
5. 使用引物Rpo-forward（5'-CGACCACTTCGGCAACCG-3'）和包含rpoB 的I区的基因组序列的区域扩增 Rpo-反向（5'-CGATCAGACCGATGTTGG-3'）。对于Mtb，使用引物 RpoTB正向（5'-ATCACACCGCAGACGTTG-3'）和RpoTB反向（5'-TGCATCACAGTGATGTAGTCG-3'） PCR混合物：2μlDNA模板，0.4μl 每种引物（10μM），1U pfu DNA聚合酶，0.6μlDMSO，0.4μldNTP （各10mM），H 2 O至20μl。
  PCR循环：95℃60秒，95℃20秒，58℃10秒和72℃40秒的30个循环。
  注意：大多数利福平 - 抗性突变发生在簇中 rpoB的I区。如果在这个区域没有检测到突变，它可能需要扩增整个rpoB基因（〜3.5 Kbp）进行测序。
6. 的然后对PCR产物进行双向测序和突变通过BLAST或ClustalW鉴定测序区域的光谱
7. 计算每个特定突变光谱的突变频率（表1）。
  突变给定突变频率的频率=（比例菌株A的突变谱）×（菌株A的突变频率）。例如，Msm的突变频率为10×10 -8 -8 /比例的M-M衍生的利福平抗性突变体中的CG-TA突变是80％因此，CG-TA突变频率将为0.8×10×10 -8 -8 = 8× 10 ^-8。
  
  表1 mazG -null Msm表现出升高的CG至TA突变在氧化应激条件下和在稳定期。自发从3个独立的收集利福平抗性集落实验。使用pfu DNA将PCR扩增rpoB 的I区聚合酶并双向测序。所有的排序集落含有单个非同义突变。 wt，野生型Msm; Δ mazG ， mazG -null Msm。

食谱

7H9培养基（100ml）将0.47g 7H9肉汤溶解在80ml dH 2 O中加入0.4ml 50％甘油和0.5ml 10％吐温80 dH 2 O至100毫升
高压灭菌
灭菌储存在4°C
7H9OADC培养基（100ml）将0.47g 7H9肉汤溶解在80ml dH 2 O中加入0.4ml 50％甘油和0.5ml 10％吐温80 dH 2 O至90ml
高压灭菌
灭菌冷却至50-55℃，加入10ml OADC
储存在4°C
7H11琼脂（100ml）将2.1g 7H11琼脂与99ml dH 2 O溶解加入1ml 50％甘油
高压灭菌
灭菌储存在4°C
7H11OADC琼脂（100ml）将2.1g 7H11琼脂与89ml dH 2 O溶解加入1ml 50％甘油
高压灭菌
灭菌冷却至50-55℃，加入10ml OADC
储存在4°C
LBG琼脂（100ml）将1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g NaCl和1.5g琼脂与99ml dH 2 O溶解。
加入1ml 50％甘油
高压灭菌
灭菌储存在4°C
PBST
将以下物质溶解在800ml dH 2 O 2中 8克NaCl
0.2克KCl
1.44g的Na 2 HPO 4
0.24g的KH 2 PO 4 sub/
5ml 10％吐温80 将pH调节至7.2
使用dH <2> O调节音量至1 L
高压灭菌
灭菌
TE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH8.0） 1mM EDTA

致谢

该协议改编自先前发表的论文Lyu等人。（2013）。这项工作得到中国国家自然科学基金（30970077,31121001,31300126），李嘉诚健康科学研究所研究单位基金（7103506），香港健康和医学研究基金（No. 12110622），中国博士后科学基金（No. 20110490754），SIBS博士后研究基金（No. 2011KIP509）。

参考文献

Lyu，L.D.，Tang，B.K.，Fan，X.Y.，Ma，H。和Zhao，G.P。（2013）。分枝杆菌MazG通过清除5-OH-dCTP来保护基因稳定性。 PLoS Pathog 9（12）：e1003814。