材料和试剂

脉冲追逐
1. 悬浮在悬浮液中的细胞
2. HBSS（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：14175-095）
3. 无甲硫氨酸和半胱氨酸的RPMI（Sigma-Aldrich，目录号：R7513）
4. 透析的FBS（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：26400044）
5. （NEM）（Sigma-Aldrich，目录号：R3876）。
6. 环己酰胺（CHX）（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
7. Express S蛋白标记混合物（Perkin Elmer，目录号：NEG072014MC）
8. 甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M5308）
9. 半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
10. 标签介质（参见配方）
11. Chase介质（见配方）
12. 2x停止缓冲区（参见配方）
细胞裂解和免疫沉淀
1. 抗感兴趣的蛋白质的抗体
2. 蛋白A/G珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：20422）
3. 完全蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics，目录号：11836145001）
4. 裂解缓冲液（见配方）
SDS-PAGE
1. 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶（Life Technologies，Invitrogen ）
2. MOPS运行缓冲液（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：NP0001）
3. 扩增溶液（GE Healthcare，目录号：NAMP100）
4. 凝胶干燥溶液（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：LC4025）}
5. 凝胶固定溶液（见配方）

设备

孵化器
Eppendorf管
26号针
1 ml注射器
热块
凝胶干燥器
荧光成像屏

程序

在单个管中对细胞进行脉冲标记和追踪，并且对于追踪的每个时间点从该管中取出细胞的等分试样。
在确定追踪时间点（x）的数目后，为实验准备足够的细胞（x + 1,2x 10 6个样品）。见注1。

脉冲追逐
1. 用2ml HBSS洗涤细胞（每个样品2×10 6个）。
2. 粒细胞在500×g下在室温下温育3分钟。重悬细胞在2毫升/样品的预热标记培养基。轻轻混匀。
3. 孵育细胞在37℃培养箱中20分钟。
4. 在室温下将沉淀细胞以500×g离心3分钟并重悬细胞在100μl/样品的预热标记培养基中。保持细胞 37℃，在标记过程中在水浴或培养箱中追逐期。
5. 在37℃下用[^{S]甲硫氨酸（100μCi/ml）（参见注2）脉冲2分钟。}
6. 加入400μl/Chase培养基的样品。轻轻地上下移动以确保正确混合。
7. 立即取出500μl的0分钟样品。转移到 Eppendorf管中装入500μl2×冰冷的终止缓冲液（见注释 3）。
8. 在4℃下以500×g离心细胞2分钟，冷冻沉淀
9. 对每个时间点重复步骤7-8。
10. 继续细胞裂解或保持颗粒冷冻在-80℃
细胞裂解和免疫沉淀
1. 向每个细胞沉淀中加入1ml冷裂解缓冲液
2. 应用机械剪切力通过使其通过26-规格的细胞裂解物针连接到1ml注射器（重复5-10次彻底裂解）。在冰上孵育15分钟。在4,000rpm下旋转16,000in x g 15分钟 ℃澄清裂解液。将澄清的细胞提取物转移到新的管
3. 向等体积的细胞提取物中加入抗感兴趣的蛋白质的抗体，并在4℃下旋转过夜（参见注释4）
4. 加入30微升蛋白A/G珠，并在4℃下再孵育2小时
5. 用1ml裂解缓冲液洗涤免疫沉淀两次
6. 加入50μl无还原剂（如DTT或2-巯基乙醇）的样品缓冲液。见注5.
7. 将样品在65℃加热5分钟。在进行非还原SDS-PAGE之前简单离心。
SDS-PAGE
1. 加载25微升免疫沉淀在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上
2. 将凝胶在室温下浸入固定缓冲液中15-30分钟
3. 将凝胶在室温下在扩增溶液中浸泡15分钟
4. 将凝胶在凝胶干燥溶液中在室温下浸泡15分钟
5. 在选择的凝胶干燥器顶部的滤纸上干燥凝胶。
6. 在暴露于荧光成像屏幕后，可以显现[35 S]甲硫氨酸标记的蛋白质。

代表数据

本文所述的方案用于检查五聚体IgM复合物在通过分泌途径途径期间的成熟动力学。 IgM组装开始于重链（H）和轻链（L）的偶联，产生单体重链和轻链中间体（HL）。组装H2L2单元，随后是"H2L2"的大多聚体。在追踪时间的后面的点，由于成功的IgM的成功组装和分泌，这些IgM中间体，特别是高分子量物质的信号将减少。

图1. I.29μ ⁺ 小鼠淋巴瘤细胞用 S-methoninie 2分钟，并按指定时间追踪。细胞提取物用αIgM免疫沉淀，免疫沉淀物通过非还原SDS/PAGE分离。指示IgM装配中间体

笔记

为了确保每个样品中使用相等数量的细胞，必须在开始实验之前确定追踪时间点（x）的数量和追踪培养基的量。我们通常准备足够的细胞和介质为x（追逐时间点的数量）加1，以解释实验期间的任何液体损失。
与放射性氨基酸的孵育时间应根据目标蛋白和使用的细胞进行优化。随后，保持标记步骤一致，特别是细胞数量和用放射性氨基酸的"脉冲"时间，将减少最终结果的变异性。
或者，可以将细胞直接加入到冰冷的2x裂解缓冲液中，并且可以立即开始细胞裂解。
应当根据每种抗体和抗原确定和优化待添加的抗体和细胞提取物的量以及抗体 - 抗原结合的孵育时间。孵育时间可以在4℃下从1小时到过夜不等。
如果不监测二硫键形成，可以使用具有还原剂的变性样品缓冲液
透析的FBS用于防止"冷"甲硫氨酸和半胱氨酸的污染。添加到培养基中的量应根据所用的细胞系确定。
加入环己酰胺（CHX）以降低新翻译的蛋白质的水平。 CHX以及"冷"甲硫氨酸和半胱氨酸应该新鲜加入到培养基中
NEM是共价连接到在半胱氨酸上发现的游离SH-基团的烷化剂。加入它以防止追赶期结束后形成二硫键。在追踪二硫键形成的脉冲追踪实验中，必须向停止和裂解缓冲液中加入NEM。

食谱

标记媒体
缺乏甲硫氨酸或半胱氨酸的RPMI 1％青霉素和链霉素 1％谷氨酰胺 5-10％透析的FBS（参见注释6）
Chase介质（见注7）
标签介质（见上文）加上
5mM半胱氨酸 5mM甲硫氨酸 1 mM CHX
2x停止缓冲区
HBSS与40mM NEM（参见注释8）
裂解缓冲液
50mM Tris（pH7.4） 150mM NaCl 0.5％NP-40
0.5％脱氧胆酸钠 20mM NEM
蛋白酶抑制剂
凝胶定影液
25％甲醇
15％乙酸

致谢

本文提供的方案改编自van Anken等人（2009）。这项工作部分得到国立卫生研究院（CA082057，CA31363，CA115284，CA180779，AI105809和AI073099）的赠款支持;黑斯廷斯基金会; Fletcher Jones基金会和BaCaTec（J.U.J.）。我们还感谢Jung实验室成员的支持和讨论。

参考

van Anken，E.，Pena，F.，Hafkemeijer，N.，Christis，C.，Romijn，EP，Grauschopf，U.，Oorschot，VM，Pertel，T.，Engels，S.，Ora，，V.，Glockshuber，R.，Klumperman，J.，Heck，AJ，Luban，J。和Braakman，I。（2009）。有效的IgM装配和分泌需要浆细胞诱导的内质网蛋白pERp1。 Proc Natl Acad Sci USA 106（40）：17019-17024。
Wong L.Y.，Brulois K.，Toth Z.，Inn K.S.，Lee S.H.，O'Brien K.，Lee H.，Gao S.J.，Cesarman E.，Ensser A.and Jung J.U。（2013）。卡波西肉瘤相关疱疹病毒立即早期基因K4.2的产物调节免疫球蛋白分泌和钙稳态与pERP1相互作用并抑制pERP1。 Virot 87（22）：12069-12079。