材料和试剂

来自野生型小鼠的脾细胞
PBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP399-20）
注意：10×溶液，在蒸馏水中稀释至1×，并通过高压灭菌器灭菌。
RBC裂解缓冲液（eBioscience，目录号：00-4333-57）
不含Ca 2+和Mg 2+的HBSS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14175-095）
RPMI-1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-119）
胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11055H）
青霉素/链霉素（Gemini Bio-Products，目录号：F52M00E）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030-081）
台盼蓝溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：15250-061）
OVA 257-264合成肽（Sigma-Aldrich，目录号：S7951）
5（6） - 羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Sigma-Aldrich，目录号：21888）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D-8418）
胶原酶D（Sigma-Aldrich，目录号：C-5138）
Percoll（Sigma-Aldrich，目录号：P-1644）
完成RPMI-1640介质（参见配方）
100％percoll溶液（见配方）

设备

离心机（Thermo Fischer Scientific，Sorvall Legend RT）
37°C水浴
血细胞计数器
15 ml和50 ml Falcon管
6孔板（USA Scientific，CytoOne ，目录号：CC7682-7506）
BD LSRII流式细胞仪（BD）
70μm细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352350）
具有细胞过滤帽的5mL聚苯乙烯圆底管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352235）
3ml注射器（BD，目录号：14-823-435）

程序

无菌组织培养条件下的靶细胞制备
该步骤用于使用CFSE制备肽脉冲的靶细胞和染色细胞，以区分肽脉冲的靶细胞与对照靶细胞。
1. OVA <257> 257> 靶向细胞的肽负载。
  1. 脾细胞被RBC裂解，然后用PBS洗涤两次。
  2. 将细胞重悬在RPMI-1640完全培养基中
  3. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数单核细胞
  4. 以5×10 6个/ml的RPMI-1640完全培养基重悬细胞。
  5. 将细胞平均分成两个单独的50毫升Falcon管 - 一个肽脉冲的靶细胞，另一种用于未脉冲的靶细胞。
  6. 将来自200μM储液的OVA 257-264肽以1μl/ml加入肽脉冲的靶细胞。
  7. 添加等量的PBS到未突发的靶细胞
  8. 孵育细胞在37℃水浴1小时。
  9. 用RPMI-1640完全培养基洗涤细胞两次。
  10. 在4℃下以1,500rpm离心细胞3分钟。
  11. 在HBSS中重悬细胞沉淀。
2. 在无菌组织培养条件下的CFSE细胞标记。
  1. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数所有活细胞
  2. 以5×10 7 /μL/ml重悬细胞于HBSS中
  3. 解冻5mM储备CFSE溶液的等分试样
  4. 通过在DMSO中稀释5mM储备液（1:10）（最终浓度为0.5mM）制备新鲜的CFSE ^低储液。
  5. 孵育具有较高浓度的未刺激的靶脾细胞的CFSE（CFSE ^高）：每毫升添加1μl的5mM储备CFSE 的未刺激靶细胞（最终浓度为5μM）
  6. 孵育具有较低浓度的脉冲目标脾细胞 CFSE（CFSE ^低）：将1μl的0.5mM储备CFSE加入每毫升肽脉冲的细胞（最终浓度为0.5μM）
  7. 吸管细胞上下混合，在水浴中孵育10分钟 37℃。定期轻轻搅拌细胞。
  8. 加入10倍体积的预热RPMI-1640完全培养基到CFSE标记的细胞停止反应。
  9. 颗粒细胞在4℃下以1,500rpm离心3分钟
  10. 取出上清液，并将沉淀重悬在冷RPMI-1640完全培养基中
  11. 用冷RPMI-1640完全培养基洗涤细胞两次以上。
  12. 使用血细胞计数器通过台盼蓝排除计数单核细胞
  13. 用冷PBS洗涤细胞。
  14. 以6.7×10 6 /μL/ml重悬在PBS中的每个细胞群体
  15. 将等体积（〜等数量）的肽脉冲的CFSE低级细胞与未刺激的CFSE sup细胞组合，并进行流式细胞术分析（图1a）。
静脉注射靶脾细胞
为了研究OVA 257-264特异性CD8 + T细胞杀伤能力，将肽脉冲的和未脉冲的靶细胞以1:1的比例混合并转移至先前免疫的老鼠。
1. 用表达鸡卵清蛋白（LM-OVA）的5,000个集落形成单位（CFU）的单核细胞增生李斯特氏菌感染受体小鼠7天在CFSE标记的细胞注射前静脉内
2. 注入静脉内300微升的组合细胞群体进入尾静脉的每个收件人。每个受体应该接受约1×10 7个肽脉冲的靶细胞与1×10 7个未脉冲靶细胞的组合。
3. 等待4小时。
用于流式细胞术分析的肝脏中脾细胞和淋巴细胞的制备
该步骤通过对CFSE ^low和CFSE ^{hi细胞群体的流式细胞术分析来分析肝脏和脾脏中的抗原特异性杀伤能力。准备脾细胞进行流式细胞术分析。用PBS洗涤一次，并通过细胞过滤器将2-300μl加入5ml圆底管中。

从肝脏分离淋巴细胞。从收件人收获肝脏，并将它们放在冰上
通过在PBS中稀释20mg/ml储备液1:20（最终浓度为1mg/ml）制备新鲜的胶原酶D溶液。

用玻片上的刀片切碎肝脏，并将其转移到50ml的falcon管中。

加入7毫升胶原酶D（1毫克/毫升），并充分涡旋
在37℃下在水浴中孵育30分钟。每15分钟涡旋一次。

将管置于冰上，并在6孔的孔上加入70μm滤器上的上清液孔板。研磨大块的切碎的肝脏与平部分3毫升注射器。用5ml PBS洗涤管，并重复磨削。

将其转移到50ml Falcon管中，在4℃下以2,000rpm离心5分钟
制备新鲜的44％和66％的percoll溶液：使最终浓度为44％通过稀释在PBS中的100％percoll，并使66％的最终浓度在RPMI-1640培养基中稀释100％percoll。

重悬在7毫升的44％percoll丸，并加载到3毫升的66％percoll在15毫升管中。
注意：梯度分离对搅拌敏感。尽量不要摇动管。

在4℃下以3,000rpm离心30分钟，无制动
将间期淋巴细胞转移到一个新的15毫升管
将细胞在4℃以2,000rpm离心5分钟
用PBS洗涤一次，并通过细胞过滤器转移2-300μl到5ml圆底管。

进行脾和肝样品的流式细胞术分析（图1b）。

图 1.在抗原脉冲的靶细胞和未刺激的靶中的CFSE表达。肽脉冲的CFSE ^低和未突变的CFSE ^hi脾细胞在转移到接受者之前以1:1的比例混合。 b。的将肽脉冲和未脉冲的脾细胞的混合物转移入在感染后第7天，LM-OVA易感染小鼠。脾和在4小时后收获受体的肝以确定在CFSE ⁺细胞中CFSE ^低和CFSE ^hi细胞的百分比。}

食谱

完成RPMI-1640培养基
10％FBS
1％青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺
100％percoll溶液
90％的percoll
10％的10x PBS

笔记

梯度分离对搅拌敏感。尽量不要摇晃管子。

致谢

该方案改编自先前描述的研究（Manjunath et al。，2001）。这项工作由Starr癌症联盟（13-A123到M.O.L.和M.Q.Z.），Rita Allen基金会（M.O.L.），NBRPC（2012CB316503到M.Q.Z）和NIH（HG001696到M.Q.Z.）支持。

参考文献

Ingulli，E。（2007）。通过对所施用细胞的CFSE标记，跟踪体内耐受性和免疫力。 Methods Mol Biol 380：365-376。
Kim，M.V.，Ouyang，W.，Liao，W.，Zhang，M.Q.and Li，M.O。（2013）。转录因子Foxo1控制中枢记忆CD8 ⁺ T细胞应答感染。免疫 39（2）：286-297。