材料和试剂

种子（50mg）
2,3,5-三苯基四唑氯化物（四唑红）（Sigma-Aldrich，目录号：T8877）
95％乙醇（分光光度级）
蒸馏水或超纯去离子水

设备

棕色瓶
1.5 ml微量离心管
微量离心机管架
铝箔
空气培养箱（设定为30℃）
1 ml移液管（，例如，Gilson）
杵和臼
一次性巴斯德移液器（玻璃）
分光光度计
分光光度计比色杯（聚苯乙烯，1.5ml，路径长度1cm）
微量离心机
带有彩色摄像机的立体显微镜

程序

准备1％（w/v）的四唑红色水溶液，并存储在一个棕色的瓶子。将培养箱温度设置为30°C
每个样品称取50±1mg干燥种子，并将其放置在1.5ml微量离心管中。每个样品至少应有三次重复。为了测量时间过程中的渗透性，选择至少5个时间点（例如4小时，24小时，48小时，72小时，96小时）并相应地分配种子样品（重复）。
向每个含有种子的管中加入1ml的1％四唑红色溶液。将这些管放置在微量离心管架中，并用铝箔覆盖（孵育必须在黑暗中进行）。将它们在空气孵化箱中在30°C下选择的特定时间段。使用水代替四唑红的阴性对照应该在第一次进行测定时进行。
在每个时间段的孵育完成后，取出具有种子的试管用于观察。观察种子颜色变化（寻找红色的形成），并使用立体显微镜（图1）对一些种子进行成像。种子可以保持在室温下显微镜成像，但他们应在1小时内成像。如果更长，保持种子在4℃。
对于甲的提取，使用1ml移液管将管内容物（种子和1％四唑红色溶液）转移到研钵中。
注意：
2. 提取应在每个时间点后立即执行（不要存储时间点，一次执行所有操作）。
使用玻璃巴斯德移液管从研钵中取出1％的四唑红色溶液并丢弃。用蒸馏水洗涤种子两次，使用巴斯德吸管冲洗。从砂浆中取出水并丢弃
在研钵中向种子中加入1ml的95％乙醇，并使用杵仔细研磨种子。使用巴斯德移液管将整个磨碎的种子材料在乙醇溶液中转移到一个新的微量离心管，并调整最终体积用95％乙醇至1.5ml
立即在15,000×g离心管离心3分钟。收集上清液到分光光度计比色皿（图2）。
注意：步骤7和8必须迅速进行，以避免种子破坏后四唑盐与胚胎细胞的反应。
使用分光光度计，在485nm处测量甲an提取物的吸光度（图2）并绘制读数。使用95％乙醇作为参考（空白）。

代表数据

在Col-WT和种皮通透性突变体的种子中在30℃下在1％四唑红中孵育并在立体显微镜下在48小时结束。 gpat5 突变体严重受影响，并且far1 far4 far5 三重突变体受到中度影响（Vishwanath等人，2013）。

图2.在分光光度计比色杯中收集的formazan提取物的实例，并准备进行吸光度测量。提取物来自48小时时间点。每个比色杯下面的数据是三次重复的平均值。 gpat5 突变体严重受影响，并且far1 far4 far5 三重突变体受到中度影响（Vishwanath等人，2013）。

笔记

重要的是使用相对新鲜收获的种子（少于6个月大）。如果比较基因型，植物应该一起种植，种子同时收获
对于每个样品，种子应均匀地研磨
避免收集任何种子碎片，同时将上清液转移到分光光度计比色皿
每次样品读数都使用新鲜的比色杯。
所有样品的吸光度值应尽可能快地测量。阅读样本之间不应有大的时间间隔。
对于高于0.8的吸光度值，应在95％乙醇中稀释样品，以保持在分光光度计的线性范围内。然后使用稀释因子计算原始样品的吸光度

致谢

该方案改编自Molina等人（2008）。这项工作是由一个发现授予O.R. 来自加拿大自然科学和工程研究理事会。

参考文献

Berridge，M.V.，Tan，A.S.，McCoy，K.D.and Wang，R。（1996）。使用四唑盐的细胞增殖测定的生化和细胞基础。 4（1）：15-19。
Molina，I.，Ohlrogge，J.B.and Pollard，M。（2008）。沉积和定位脂质聚酯在欧洲油菜的发育种子中和< em> Arabidopsis thaliana 。 Plant J 53（3）：437-449。
Vishwanath，SJ，Kosma，DK，Pulsifer，IP，Scandola，S.，Pascal，S.，Joubes，J.，Dittrich-Domergue，F.，Lessire，R.，Rowland，O。和Domergue，）。拟南芥中的Suberin相关脂肪醇：根系中的分布和对种子外壳屏障性质。植物生理学 163（3）：1118-1132。