材料和试剂

低温保存的CBMC
冷冻保存的PBMC
EBV菌株B95-8含有上清液
注意：这里的批次的滴度为2.5 x 10 ⁵ Ramos感染单位。 RaIU，其通过EBV阴性Burkitts淋巴瘤B细胞系Ramos的感染测定，随后是抗补体免疫荧光测定（ACIF）以检测感染细胞的数目。
RPMI 1640（Life Technologies）
10％热灭活胎牛血清（Hyclone）
L-谷氨酰胺（2mmol/l）
青霉素G钠（100U/ml）
链霉素硫酸盐（100mg/ml）（Merck KGaA）
完整的细胞培养基（参见配方）

设备

48孔平底组织培养处理的平板（Sarstedt AG）
具有用于调节37℃和5％CO 2的细胞培养的湿润培养箱

程序

关于样品处理的注意事项：在分离单核细胞期间温和且快速处理样品有助于更高的B细胞活力，这是成功的体外感染的核心。

在室温下迅速解冻CBMC或PBMC，并用350-400×g的不完全RPMI-1640洗涤两次，室温下5-10分钟。
确定细胞数量，如果适用，将细胞分为将被EBV感染的分数和将作为未感染对照的分数。
注意：请记住，每个孔中的细胞数量和浓度应与感染和非感染级分匹配。
用RPMI 1640再冲洗一次。
对于未感染的对照培养物：将完全细胞培养基中的细胞重悬浮至10 6个细胞/ml的浓度，并分配至板中的合适孔中。在37℃和5％CO 2下孵育
对于EBV感染，完全丢弃上清液，并在小管中将每100μl含B95-8病毒的上清液重悬106个细胞。在37℃和5％CO 2下孵育90分钟，伴随轻柔混合，每30分钟旋转管。
用完全细胞培养基洗涤细胞一次，弃去上清液并重悬于完全细胞培养基中至10 6个细胞/ml的浓度，然后分配到板中的合适孔中。
每周用完全培养基饲养细胞。 EBV转化的B细胞的比例将随时间增加，并且最终这些细胞接管整个培养物。当我们评估NK和T细胞的动力学和它们的功能能力（Sohlberg等人，2013; Saghafian-Hedengren等人，2013）在我们先前的实验设置中，我们发现1-2周期的时间适合此目的。
EBV感染的细胞的存在可以通过对潜伏膜蛋白-1和EBV核Ag 2的免疫荧光染色来证实（Rasul等人，2012）。

代表数据

参见图1在Sohlberg等人（2013）关于B细胞体外EB病毒感染的B细胞特征的代表性数据。

笔记

在单核细胞分离期间仔细和快速处理样品有助于更高的B细胞活力，这是成功的下游体外EB病毒感染的中心。
该协议使用来自EBV血清阴性供体的细胞。在EBV体外感染之前消耗T细胞（通过例如基于磁性的方法从StemCell TM或Miltenyi Biotech去除CD3 +细胞）如果样品来自EBV血清阳性供体

食谱

完成细胞培养基
10％热灭活胎牛血清
L-谷氨酰胺（2mmol/l）青霉素G钠（100U/ml）链霉素硫酸盐（100mg/ml）

致谢

该协议已经从先前发表的论文Sohlberg等人，（2013）改编而来。在制定和实施本议定书时，使用了以下资金来源：瑞典研究委员会批准57X-15160-07-03和57X-15160-10-4，瑞典过敏协会，RagnarSöderberg基金会，艾伦，沃尔特和伦纳特·赫塞尔曼基金会，Konsul Th。 C. Bergh基金会，金禧纪念基金会，Petrus和Augusta Hedlund基金会，皇冠公主Lovisa的/Axel Tielman的基金会，瑞典癌症协会和Karolinska研究所。 E.R.和N.N.是来自癌症研究所（纽约）/关注基金会（洛杉矶）的癌症研究奖学金的接受者。我们感谢Ehsan Rasul和Eva Klein（微生物学，肿瘤和细胞生物学系，KI，斯德哥尔摩，瑞典）对优化方案的贡献。

参考文献

Rasul，A.E.，Nagy，N.，Sohlberg，E.，Adori，M.，Claesson，H.E.，Klein，G.and Klein，E。（2012）。同时检测两种主要增殖驱动EBV编码的蛋白质，EBNA-2和LMP-1单一B细胞。 J Immunol Methods 385（1-2）：60-70。
Saghafian-Hedengren，S.，Sohlberg，E.，Theorell，J.，Carvalho-Queiroz，C.，Nagy，N.，Persson，JO，Nilsson，C.，Bryceson，YT and Sverremark-Ekström，）。爱泼斯坦 - 巴尔病毒在儿童中的合并感染促进巨细胞病毒诱导的自然杀伤细胞分化。 J Virol 87（24）：13446-13455。
Sohlberg，E.，Saghafian-Hedengren，S.，Rasul，E.，Marchini，G.，Nilsson，C.，Klein，E.，Nagy，N.，Sverremark-Ekström，巨细胞病毒 - 血清反应阳性的儿童显示出体外EB病毒感染的抑制作用与CD8 + sup/+ CD57 + sup + T细胞富集和IFN-γ。 191（11）：5669-5676 。