材料和试剂

如先前所述分离hMADS细胞（Rodriguez等人，2005）
灌注缓冲液储备溶液（sPB）
Liberase blendzyme TM（Roche Diagnostics，目录号：05401119001）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4549）
氯化钙
膜联蛋白V/7AAD染色（BD Biosciences，目录号：559763）
18α-甘草次酸（18α-GA）（Sigma-Aldrich，目录号：G-8503）
M Latrunculin A（Life Technologies，目录号：L12370）
诺考达唑（Sigma-Aldrich，目录号：M-1404）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S0876）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9397）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：P9144）
1M HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：M3375）
牛磺酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0625）
酚红（最后）（Sigma-Aldrich，目录号：P5530）
5.5mM葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
0.25mg/ml解放酶混合酶（Roche Diagnostics，目录号：1988417）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4549）
10％新生小牛血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：16010167）
5％牛血清（BCS）（HyClone，目录号：SH30073）
戊巴比妥钠（CEVA，CIP编号：6742145）
肝素胆固醇（sanofi-aventis，CIP number：3048450）
1x灌注缓冲液储备溶液（参见配方）
2,3-丁二酮单肟（BDM）（Sigma-Aldrich，目录号：B0753）（参见配方）
灌注缓冲液（pH 7.46）（PB）（见配方）
消化缓冲液（参见配方）
停止缓冲区1（请参阅配方）
停止缓冲区2（请参阅配方）

设备

兰登多夫装置（见下文）

图1. Langendorff设备
37℃水浴
外科手术丝4.0
培养皿（Dutscher Scientific，目录号：628103）
外科手术器械
一次性移液管（VWR International，目录号：612-1681）
Falcon 15ml丙烯锥形管（Dutscher Scientific，目录号：352095）

程序

心肌细胞分离
根据O'Connell T，Ni Y.的AfCS Procedure Protocols PP00000125，从2至5个月龄的雄性C57BL/6J小鼠（Janvier）获得心室心肌细胞。
1. 灌注缓冲液，消化缓冲液，停止缓冲液（1和2）必须每天准备
2. 灌注缓冲液和消化缓冲液必须在使用前温热至37°C。
3. 准备Langendroff灌注仪。循环水浴设置为使得从套管的尖端的流出量为37℃。灌注系统用100ml纯水然后用灌注缓冲液至少5分钟和气泡被消除。
4. 用戊巴比妥（60mg/kg）和接受肝素（200UI/kg）的溶液麻醉2-5个月的雄性小鼠。
5. 切除心脏并在Langendorff装置上灌注无钙氧合（95％O 2 H 2，5％CO 2）灌注缓冲液中37℃。
6. 然后，用消化缓冲液灌注心脏几分钟，相同的无钙灌注缓冲液补充有0.25mg/ml 自由酶混合酶TM，0.14mg/ml胰蛋白酶和12.5μM钙氯化物。
7. 取出心脏，置于含有停止物的盘中缓冲液1，并使用小剪刀进一步切成小块。去除卵泡和主动脉。细胞解离通过停止缓冲液1时轻轻机械搅拌。
8. 细胞悬浮液转移到15ml聚丙烯锥形管中。的板用2.5ml室温终止缓冲液1冲洗然后将洗涤溶液加入到细胞悬浮液中达到最终体积为5毫升。停止缓冲液1含有血清灭活蛋白酶。最终小牛血清浓度为5％，最后钙浓度为12.5μM。
9. 在37℃下在15ml管中通过重力将心肌细胞沉降8-10分钟。
  对于每个管，沉淀后除去上清液，沉淀重悬于5ml加入的终止缓冲液2中增加Ca ^{2 +}的浓度 5ml SB2 +50μl10mM Ca 2+ +（112μM）
  5ml SB2 +100μl10mM Ca 2+（212μM）
  5ml SB2 +25μl100mM Ca 2+ 2 +（500μM） 5ml SB2 +50μl100mM Ca 2+（1mM）
10. 在膜联蛋白V/7AAD染色后通过流式细胞术分析评价新鲜分离的CM的存活力
  
  图2.新鲜分离的小鼠CM的苦难状态（Figeac ，2014）
椰子树
注意：
1. 将新鲜分离的小鼠心肌细胞与间充质共培养干细胞在不同条件下根据参数进行评估。
2. 虽然我们的大多数实验是用hMADS进行的细胞，其中一些是用hMSC从骨髓中慷慨赠送的来自EFS，Créteil（Acquistapace，et al。，2011）。
1. 为了评估心肌细胞重编程过程，将共培养物放入 DMEM，补充有10％FBS，金刚霉素（1/500）和Fungizone （1/100）以1:1的比例接种，每种细胞类型以每平方3500个细胞接种厘米。
2. 以防止两个电池之间的物理接触类型，含有聚碳酸酯膜的细胞培养插入物使用不同的孔径（从0.4μm直至3μm孔径）。
  注意：我们使用1μm的孔径插入物，其允许可溶性的扩散因子，外来体和大微粒作为凋亡体证明这些细胞与细胞的通信途径不是参与间充质干细胞旁分泌的改变共同培养。我们还使用0.4μm的孔径，允许扩散可溶性因子和小的外来体，但阻碍了转移微细胞和凋亡小体以确认细胞与细胞通过可溶性可溶性因子和外来体的交流没有影响干细胞表型和杂交心脏的产生祖细胞。
3. 测量由MSC释放的可溶性因子在共培养期间，将两种细胞类型中的每一种以10 5细胞/ml（比率1:1）接种在含有少量胎儿的生长培养基中小牛血清，即补充有0.8％FBS，庆大霉素的DMEM （1/500）和Fungizone（1/100）。
4. 作为这些的控制实验，hMADS和成人心肌细胞以10 5个细胞/ml接种的补充有10％和0.8％FBS的DMEM 考虑。我们使用10％FBS浓度进行实验表征细胞融合过程和表型的结果杂交细胞。我们使用0.8％FBS浓度研究secrettome变化通过共培养诱导以降低污染的风险血清中所含的可溶性因子
5. 确定通信途径参与hMADS的旁分泌激活细胞，我们在几个存在的情况下进行共培养实验药理化合物。在0.8％FBS中进行新鲜共培养 DMEM培养基中，在100mM18α-甘草次酸存在下培养24小时抑制间隙连接和2.5×10 -8 M M Latrunculin A或5×10 8个 M 诺考达唑，以抑制隧道纳米管形成。

代表数据

图3.在第0天hMADS细胞（黑色箭头）和小鼠成年心肌细胞（黄色箭头）之间的共培养。比例尺，30μm（Acquistapace等人，2011）

食谱

1x灌注缓冲液储备溶液（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000452，来自Kachura M）
113mM氯化钠（NaCl）
4.7mM氯化钾（KCl）
0.6mM磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
0.6mM磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
1.2mM硫酸镁七水合物（MgSO 4）7H 2 O 7H 2 O） 12mM碳酸氢钠（NaHCO 3）
10mM碳酸氢钾（KHCO 3）
10mM HEPES缓冲液1MW / 30 mM牛磺酸 0.032mM酚红（最后）
将所有组分加入到在2L烧杯中的900ml纯化水中搅拌至所有组分完全溶解
转移到1升量筒，用纯水
调节终体积至1升用10ml纯净水
预洗0.22μm过滤器消毒溶液
储存在4°C
2,3-丁二酮单肟（BDM）（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000438）
500mM 2,3-丁二酮单肟
称重BDM，并在100ml烧杯中加入30ml纯净水搅拌至溶液完全溶解
将转移溶液转移至50ml量筒中，并用纯化水
调节终体积至50ml 用10ml净化水预洗0.2μm过滤器通过过滤预过滤器过滤溶液
储存在4°C
灌注缓冲液（PB）（pH7.46）（AfCS Solution Protocols，方案ID：Kachura M的PS00000451）
1x储备灌注缓冲液; 0.98x（AfCS Solution Protocols，Protocol ID：PS00000452）
500mM，10mM 2,3-丁二酮单肟（BDM）
5.5mM葡萄糖称重葡萄糖，并在1L烧杯中加入400ml储备灌注缓冲液向烧杯中加入10ml BDM并搅拌直到所有组分完全溶解
将转移溶液转移到500ml量筒中，并用储备灌注缓冲液
调整终体积至500ml 用石蜡膜覆盖并通过倒转混合
用10ml纯净水
预洗一个0.22μm500 ml过滤器通过预洗过滤器单元过滤，消毒溶液
过滤后最终pH为7.46
消化缓冲液（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000447）
1×灌注缓冲液（pH 7.46） 0.25mg/ml解放酶混合酶 0.14mg/ml胰蛋白酶
12.5μM氯化钙（CaCl 2，100mM; AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000441）
称重解放酶混合酶，并在100ml烧杯中加入30ml灌注缓冲液测量并向烧杯中加入胰蛋白酶和100mM CaCl 2 搅拌，直到所有组分完全溶解
用量筒中的灌注缓冲液将终体积调整至50ml 用石蜡膜覆盖并通过倒置混合
用10ml纯净水
预洗附于60ml注射器的0.2μm过滤器通过过滤预过滤器过滤溶液
停止缓冲区1（AfCS解决方案协议，协议ID：PS00000449）
1x灌注缓冲液（pH 7.46）（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000451） 10％新生小牛血清
12.5μM氯化钙（CaCl 2）10mM（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000440）
吸取1ml的NCS和12.5μl的CaCl 2溶液到10ml量筒中
用灌注缓冲液
调整终体积至10 ml 用石蜡膜覆盖并通过倒置混合
用10ml净化水预洗50ml管式过滤器
通过过滤预过滤器过滤溶液
停止缓冲液2（AfCS Solution Protocols，Protocol ID：PS00000450）
1x灌注缓冲液（pH 7.46）（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000451） 5％牛血清（BCS）
氯化钙（CaCl 2）10mM（AfCS Solution Protocols，方案ID：PS00000440）12.5μM
吸移1.5ml BCS和37.5μlCaCl 2到50ml量筒中
用灌注缓冲液
调整最终体积至30 ml 用石蜡膜覆盖并通过倒置混合
用10ml纯化水预洗一个连接到35ml注射器的0.2μM过滤器通过过滤预过滤器过滤溶液

致谢

我们感谢我们已经适应和修改用于共培养方案的心肌细胞提取方案（O'Connell T的AfCS Procedure Protocol PP00000125）。该协议已经从先前发表的两篇论文中改编而来（Figeac等人，2014; Acquistapace等人，2011）。这项工作得到了法国国家卫生和医学研究所（INSERM）和协会资助 des Maladies Cardiovasculaires（AREMCAR）。

参考文献

Acquistapace，A.，Bru，T.，Lesault，PF，Figeac，F.，Coudert，AE，Le Coz，O.，Christov，C.，Baudin，X.，Auber，F.and Yiou，）。人间充质干细胞通过部分细胞融合和线粒体将成体心肌细胞重新编程为祖细胞样状态干细胞 29（5）：812-824。
Figeac，F.，Lesault，PF，Le Coz，O.，Damy，T.，Souktani，R.，Trebeau，C.，Schmitt，A.，Ribot，J.，Mounier，R.，Guguin， Manier，C.，Surenaud，M.，Hittinger，L.，Dubois-Rande，JL和Rodriguez，AM（2014）。使用不良心肌细胞的纳米管串扰刺激间充质干细胞的旁分泌修复功能。干细胞 32（1）：216-230
Rodriguez，AM，Pisani，D.，Dechesne，CA，Turc-Carel，C.，Kurzenne，JY，Wdziekonski，B.，Villageois，A.，Bagnis，C.，Breittmayer，JP，Groux，H.，Ailhaud， G.和Dani，C。（2005）。从人类脂肪组织移植多能细胞群在免疫活性mdx小鼠中诱导肌营养不良蛋白表达。 a> J Exp Med 201（9）：1397-1405。
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