材料和试剂

来自IL-33或IL-25处理的小鼠（例如C57BL/6或Balb/c）的肝脏
胎牛血清（FCS）
RPMI-1640培养基
Easycoll分离溶液（密度1.124）（Biochrom，目录号：L6145）
抗小鼠CD16/CD32（Fc-Block）（eBioscience，目录号：14-0161）
0.5M CaCl 2溶液
0.2M MgCl 2溶液
AutoMACS冲洗溶液（Miltenyi Biotec）
Brilliant Violet 421 Streptavidin（BioLegend，目录号：405226）
抗体
1. FACS抗体
  1. 抗Sca-1（克隆D7，FITC缀合的）（eBioscience，目录号：11-5981）
  2. 抗KLRG1（克隆2F1，APC缀合的）（eBioscience，目录号：17-5893）
  3. 抗ICOS（克隆7E.17G9，PE缀合的）（eBioscience，目录号：12-9942）
2. 抗小鼠谱系抗体生物素标记
  1. 抗CD3（克隆145-2C11）（eBioscience，目录号：13-0031）
  2. 抗CD45R（克隆RA3-6B2）（eBioscience，目录号：13-0452）
  3. 抗Ly-6G（克隆RB6-8C5）（eBioscience，目录号：13-5931）
  4. 抗CD11b（克隆M1/70）（eBioscience，目录号：13-0112）
  5. 抗NK1.1（克隆PK136）（eBioscience，目录号：13-5941）
  6. 抗Ter-119（克隆Ter-119）（eBioscience，目录号：13-5921）
  7. 抗SiglecF（克隆ES22-10D8）（Miltenyi Biotec，目录号：130-101-861）
  8. 抗CD5（克隆53-7.3）（Miltenyi Biotec，目录号：130-101-960）
Krebs-Ringer缓冲液（KRB）（参见配方）
胶原酶IV溶液（Sigma-Aldrich，目录号：C5138）（参见Recipes）
DNase I溶液（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）（参见Recipes）
30％Biocoll（见配方）
80％Biocoll（见配方）
FACS缓冲区（参见配方）
ACK缓冲区（参见配方）
PEB缓冲区（参见配方）

设备

GentleMACS C管（Miltenyi Biotec）
6孔板
GentleMACS解离子（Miltenyi Biotec）
MACSmix管旋转器（Miltenyi Biotec）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Multifuge X1R）
细胞分选机（例如，FACSaria，BD Biosciences）
100μm细胞过滤器（Corning，目录号：08-771-19）
血细胞计数器
15 ml Falcon管
50ml Falcon管
FACS管

程序

通过吸移新鲜制备肝脏消化溶液4.4ml Krebs-Ringer-缓冲液（KRB），25μlDNA酶I溶液，500μl胶原酶IV溶液，20μl0.5M CaCl 2和50μl0.2M MgCl 2 2>进入温和的MACS C管中。保持在37°C预热30分钟。这种解决方案确保有效的肝组织消化，而免疫细胞表面受体的蛋白水解降解是有限的。
通过颈部脱位牺牲小鼠，并在无菌台下无菌地从小鼠中取出肝脏，并将器官转移到填充有5ml KRB缓冲液的无菌6孔板的孔中。如果共分离应避免可能存在于脉管系统中的一些ILC2细胞，包括使用其他地方描述的标准技术通过门静脉系统的肝灌注。
用KRB缓冲液冲洗肝脏，并将其转移到含有预热的肝消化溶液的C管中
通过将C管应用于温和的MACS解离器并运行程序m_liver-01.02来分离组织。
注意：每个C管可以进行一个小鼠肝脏，程序可以运行2-3次，直到组织完全均匀化。
将含有匀浆组织的C管连接到MACSmix管旋转器，并在37℃下连续旋转孵育样品30分钟。
再次将管子应用到gentleMACS Dissociator并运行程序m_liver-02.02。
准备一个50毫升管和一个100微米的细胞滤网用PEB缓冲液冲洗
将取自C管的匀浆组织置于50ml管上的过滤器上，并用另外10ml PEB缓冲液洗涤过滤器。
弃去细胞过滤器，并向管中再加入20 ml PEB缓冲液。在4℃下将样品以20×g离心4分钟。这一步骤从肝细胞悬浮液中去除不需要的肝细胞
小心地从样品中除去上清液，并将其转移到新的50ml管中
通过加入30ml PEB缓冲液并在4℃下以300×g离心10分钟来洗涤细胞。
小心弃去上清液，并将细胞沉淀重悬在1ml PEB缓冲液中。
应用10毫升ACK缓冲液的悬浮液，以去除红细胞。在室温下孵育样品5分钟。
通过加入30ml PEB缓冲液并在4℃下以300×g离心10分钟来洗涤样品两次。
用5ml 80％Biocoll分离溶液填充15ml管
将分离的细胞重悬在10ml 30％Biocoll分离溶液中，并缓慢覆盖到80％Biocoll溶液中。在室温下用1,400×g离心细胞20分钟，不断裂
通过小心吸取梯度之间的界面部分到新的50ml管中，收集靶细胞
用30ml PEB缓冲液洗涤并在300×g离心15分钟
通过使用血细胞计数器计数细胞，并分配到FACS管染色
在染色之前，通过将细胞与1μl/10μLFc-Block细胞在4℃下孵育5分钟来阻断非特异性结合。
立即使用以下抗体使用制造商推荐的浓度：抗Sca-1，抗-ICOS，抗-CD25，生物素化谱系抗体进行染色。加入0.015μg/10 6个细胞的Brilliant Violet 421链霉亲和素。
在室温下孵育管20分钟。
通过加入2ml FACS缓冲液洗涤细胞，并在300×g离心10分钟。
继续FACS分拣。门控并将ILC2分选为谱系阴性，Sca-1 ⁺，ICOS ⁺，KLRG1 ⁺细胞（参见图1中的门控策略） br />

图1。门控策略

食谱

注意：所有材料和试剂应为低内毒素细胞培养质量。

Krebs-Ringer-Buffer（KRB）
154 mM NaCl 5.6 mM KCl
5.5mM葡萄糖 20.1mM NaHCO 3/v/v 用NaOH调节pH至7.4 使最终体积为1,000 ml
过滤灭菌并在4℃下保存
胶原酶IV溶液
KRB缓冲液中的5,000消化单位/ml
将储备液储存在-20°C
DNase I溶液
在KRB缓冲液
中为30,000单位/ml 将储备液储存在-20°C
30％Biocoll
36.97ml Biocoll 100％
63.03ml PBS
保持无菌于4°C
80％Biocoll
79.8ml Biocoll 100％
20.1ml PBS
保持无菌于4°C
FACS缓冲区
加入5ml胎牛血清至495ml PBS
ACK缓冲区
4.145g NH 4 Cl
0.5g KHCO 3
18.6g EDTA
500毫升蒸馏水
过滤灭菌并保持在4°C
PEB缓冲区
含有0.5％BSA和2mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水（PBS）

致谢

这项工作得到了合作研究中心796和DFG（至S.W.）的优先计划SPP1656和大学医疗中心Erlangen的临床研究跨学科中心（IZKF）的支持。

参考文献

Mchedlidze，T.，Waldner，M.，Zopf，S.，Walker，J.，Rankin，AL，Schuchmann，M.，Voehringer，D.，McKenzie，AN，Neurath，MF，Pflanz，S。和Wirtz，S 。（2013）。白细胞介素-33依赖性先天淋巴细胞介导肝纤维化。免疫 39（2）：357-371。