材料和试剂

J774A.1小鼠巨噬细胞（ATCC，目录号：TIB-67）
0.1mg/ml溶于PBS中的脂多糖（LPS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4130）
小鼠TNF-αQuantikine ELISA试剂盒（R& D Systems，目录号：MTA00B）
小鼠白细胞介素10（IL-10）Quantikine ELISA试剂盒（R& D Systems，目录号：M1000B）
含有Glutamax（Life Technologies，目录号：10569）的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11550）
青霉素 - 链霉素（Life Technologies，目录号：15140）
巨噬细胞培养基（见配方）

设备

150×15mm培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：351058）
Stericup-GP0.22μm真空过滤装置（EMD Millipore，目录号：SCGPU05RE）
12孔组织培养处理板（Corning，目录号：3512）
10ml容量血清移液管（VWR International，目录号：89130）
1.5 ml微量离心管
50ml无菌锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070）
水浴设置为37℃
移液助剂
带有摆动斗式转子的离心机和适用于50 ml锥形管的适配器
将加湿的细胞培养箱设定为37℃和5％CO 2/h
带有10倍物镜的直立显微镜
酶标仪（能够测量在450nm处的吸光度，背景校正波长为540nm或570nm）

程序

巨噬细胞培养物的制备
1. 在15cm培养皿上的巨噬细胞培养基中扩增J774A.1小鼠巨噬细胞注意：
  1. 下面的参考文献中可以找到小鼠巨噬细胞培养的详细方法。
  3. 使用培养皿允许巨噬细胞被收获测定而不解离酶并且不需要a 可破坏细胞的细胞刮刀。
2. 达到70-80％汇合时，从培养皿中吸出培养基并加入10ml新鲜巨噬细胞培养基。
3. 收获巨噬细胞通过从培养皿中洗涤他们巨噬细胞培养基，使用移液管和10ml血清移液管注意：将培养基多次喷在巨噬细胞上以从培养皿中取出细胞。
4. 将巨噬细胞悬浮液从板转移到50毫升锥形管。添加另外10毫升巨噬细胞培养基板和重复洗涤步骤。
5. 通过在200-250×g离心5-7分钟来沉淀细胞
6. 将巨噬细胞悬浮在巨噬细胞培养基中并计数细胞注意：
  1. 一个15厘米的培养皿含有70％汇合的巨噬细胞。
  2. 巨噬细胞在培养时将始终具有高存活力并如所述收获。因此，使用活力染料等因为台盼蓝用于区分活细胞和死细胞不是强制性。
7. 准备巨噬细胞在巨噬细胞培养基中的悬浮液，密度为200,000细胞/ml。
测定板的制备（图1）
1. 确定一式三份测定感兴趣样品所需的12孔细胞培养板的数目
2. 将感兴趣的测试化合物一式三份转移到12孔板的合适孔中注意：我们已经常规测试间充质干细胞的作用条件培养基，前列腺素如PGE2，各种药理学化合物，中和抗体和重组蛋白。
3. 向含有试验试剂的所有孔中加入巨噬细胞培养基至终体积为500μl 注意：如果所用的测试化合物的体积是微小的，则是有利的是首先将巨噬细胞培养基加入孔中将感兴趣的测试化合物（来自步骤B9）转移到合适的井。每个孔中的最终体积应保持500μl。
4. 向不含试验试剂的6个孔中加入500μl巨噬细胞培养基注意：这些孔将提供测定的控制。
5. 转移500微升的巨噬细胞悬浮液（100,000个细胞）每个3孔含有500μl的巨噬细胞培养基（无a 测试试剂）。
  注意：这些孔将用作未刺激的巨噬细胞对照（Mac对照，图1）。
  
  图 1.巨噬细胞测定的样品板布局。准备12孔测定板，首先将感兴趣的测试试剂加入合适的孔一式三份（这里显示在第3和4列）。然后将巨噬细胞（Mac）培养基加入到每个孔中至终体积 500μl，然后加入500μl的Mac细胞悬浮液第一列中的每个孔（未刺激的Mac对照）。 500μl的 LPS刺激的巨噬细胞（LPS-Mac）转移到每个剩余9个孔（第2,3和4列）。注意这些井中的三个不包含测试试剂（如第2列所示），因此作为LPS刺激的巨噬细胞对照（LPS-Mac对照）。的每孔的最终体积为1.0ml。为简单起见，试验试剂的车辆控制已被省略。
巨噬细胞用LPS刺激
1. 通过加入0.1 mg/ml的1:500稀释液刺激巨噬细胞 LPS的溶液到巨噬细胞悬浮液的剩余部分。至分配LPS，立即通过吹吸混合细胞悬浮液并下降10-15次。
2. 将盖放在50ml管上含有LPS刺激的巨噬细胞并孵育细胞 50ml管在室温下温育5分钟
3. 再次混合细胞然后转移500微升（100,000个细胞）到合适的孔中测试样品。另外，加入500μl的巨噬细胞悬浮液三个剩余的孔仅含有500μl巨噬细胞培养基（LPS刺激的巨噬细胞对照）（图1）
4. 摇滚板3次以将巨噬细胞均匀地分布在孔中在37℃孵育长达24小时。每个孔最后进行测定在1.0ml巨噬细胞培养基和100ng/ml中含有100,000个巨噬细胞 LPS（除了三个未刺激的对照孔）注意：我们常规地将巨噬细胞与LPS孵育约16-18小时。然而，可以检测到巨噬细胞衍生的细胞因子的丰度条件培养基早在LPS刺激后4-6小时
收集用于测定细胞因子产生的条件培养基
1. 在收集由巨噬细胞调节的培养基之前，观察培养物以验证细胞是否被适当激活（图2）注意：用LPS刺激的J774A.1巨噬细胞看起来比未刺激的巨噬细胞更大，更扁平，更颗粒。
  
  图 2.响应LPS的巨噬细胞形态的变化。 Brightfield 未刺激的巨噬细胞（左）和刺激的巨噬细胞的图像与LPS 18小时（右）。比例尺=50μm
2. 收集由巨噬细胞调节的培养基，并将其置于1.5ml微量离心管中
3. 在500×g/hr，室温下离心样品5分钟
4. 将上清液转移到新的1.5ml试管中注意：
  1. 虽然细胞沉淀不应该可见，但是在去除上清液时，应避免接触管底。
  2. 样品可立即用于ELISA测定，或等分并保存在-80℃下。
5. 涡旋培养基样品在其用于TNF-α和IL-10 ELISA测定。按照制造商提供的说明 ELISA试剂盒。可以在微量培养板上读取孔的吸光度阅读器，波长为450nm，背景波长校正设置在540nm或570nm。代表量的TNF-α和IL-10 由巨噬细胞响应LPS和测试化合物（PGE2）如下图所示（图3）。
  
  图3. LPS的作用和PGE2对巨噬细胞TNF-α和IL-10产生的影响。巨噬细胞用100ng/ml单独的LPS或LPS组合刺激18小时与1ng/ml的免疫调节因子前列腺素E2（PGE2）。 LPS增加产生的促炎细胞因子TNF-α的水平由巨噬细胞。 PGE2减弱TNF-α的巨噬细胞产生引起LPS刺激，但增强抗炎的水平细胞因子IL-10。值是平均值±SD，每组n = 3。

笔记

我们常规使用小鼠TNF-α和IL-10 ELISA试剂盒来监测小鼠巨噬细胞对间充质干细胞产生的旁分泌因子（如PGE2）反应的比活性。然而，其它巨噬细胞衍生的细胞因子的产生也通过LPS刺激增加，包括CXCL2/MIP2，MCP-1，IL-6，IL-1β和IL12-p40（Ylostalo等人， 2012）。这些细胞因子也可以通过ELISA测量
当如上所述进行测定时，条件培养基中TNF-α的水平从未刺激的巨噬细胞培养物中的10-30pg/ml增加至用LPS刺激的巨噬细胞中的800-1,200pg/ml。 LPS刺激时IL-10的水平仅轻微增加。然而，通过促进抗炎巨噬细胞表型的因子如PGE2，在LPS刺激的巨噬细胞培养物中IL-10水平可以显着增强（图3）。
LPS的不同制备物可引起巨噬细胞细胞因子产生的变化。可以调节在测定中使用的LPS的浓度以实现期望的结果。我们常规使用LPS浓度范围为10ng/ml至1μg/ml

食谱

巨噬细胞培养基（500ml）高葡萄糖DMEM含Glutamax，445 ml
胎牛血清，50ml
青霉素 - 链霉素，5ml /孔过滤灭菌（0.22μm），并在4℃下储存一个月。
使用前立即在37℃水浴中预热，

致谢

该方案改编自我们来自NIH（P40RR17447）和癌症的捐赠支持的原始工作（Bartosh等人，2013; Ylostalo等人，2012年）预防& 德克萨斯研究所（RP110620）至Darwin J.Prockop，Institute for Regenerative Medicine，Texas A& M University Health Science Center。

参考文献

Bartosh，T.J.，Ylostalo，J.H.，Bazhanov，N.，Kuhlman，J.and Prockop，D.J。（2013）。将人间质干细胞/前体细胞动态压实成球体自激活半胱天冬酶依赖性IL1信号以增强分泌炎症和免疫调节剂（PGE2，TSG6和STC1）。干细胞 31（11）：2443-2456。
Bartosh，T.J.，Ylostalo，J.H.，Mohammadipoor，A.，Bazhanov，N.，Coble，K.，Claypool，K.，Lee，R.H.，Choi，H.and Prockop，D.J。（2010）。人间质基质细胞（MSC）聚集成3D球状体增强了它们的抗炎性质。 Proc Natl Acad Sci USA 107（31）：13724-13729。
Murray，P.J。和Wynn，T.A。（2011）。巨噬细胞亚群的保护性和致病性功能。 Nat Rev Immunol 11（11）：723-737。
Ylostalo，J.H.，Bartosh，T.J.，Coble，K.and Prockop，D.J。（2012）。作为球体培养的人间充质干/基质细胞是自激活的产生前列腺素E2，其指导受刺激的巨噬细胞进入抗炎表型。干细胞 30（10）：2283-2296。