材料和试剂

来自成人干细胞的制备和分布中心的表达绿色荧光蛋白（GFP-MSC）的人骨髓间充质干细胞（ http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ）

C57BL/6J或BALB/C小鼠（2-3个月龄）（The Jackson Laboratory）

没有Ca 2+和Mg 2+（pH 7.4）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：10010）

没有Ca 2+和Mg 2+ 2+（Lonza，目录号：04-315Q）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）

0.25％胰蛋白酶与1x EDTA（Life Technologies，目录号：25200）

Minimum Essential Medium alpha（Life Technologies，目录号：12561）

Premium select胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11550）

青霉素 - 链霉素（Life Technologies，目录号：15140）

100x L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030）

用于MSC生长的完全培养基（CCM）（参见Recipes）

设备

Stericup-GP0.22μm真空过滤装置（EMD Millipore，目录号：SCGPU05RE）
水浴设置为37℃
带有摆动斗转子和适配器的离心机用于50ml锥形管
50ml无菌锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070）
将加湿的细胞培养箱设定为37℃和5％CO 2/h
具有4x和10x物镜的直立显微镜和用于可视化GFP的过滤器
29号针与1ml注射器（Terumo Europe N.V.，目录号：05M2913）
异氟烷麻醉系统与鼻锥鼻子
无菌解剖剪刀，针和弯曲镊子与锯齿边
橡胶或聚苯乙烯泡沫塑料平台
用可选的相机和显示器（图1）解剖显微镜
Illumatool Bright Lights系统LT 9900具有荧光附件（Lightools Research）和GFP滤光片组（图1）

图1.从小鼠腹膜可视化和收集GFP-MSC聚集体/球体所需的设备。可以使用具有落射荧光附件的解剖显微镜在小鼠腹膜中可视化GFP-MSC聚集体/球体和GFP滤光片组。可以使用安装在解剖镜体上的适当的相机获取高质量的图像（相机不是收集聚集体的必要条件）。

程序

确定将注射GFP-MSC的动物数量和所需的细胞数。
注意：我们已成功为每只动物注射1-3 x 10 ⁶ GFP-MSCs，
在CCM中从低密度接种（100-300个细胞/cm 2）扩增GFP-MSC 6-7天。在达到70％汇合时，使用胰蛋白酶/EDTA收获GFP-MSC，然后通过在450×g离心5-7分钟收集细胞。
注意：适当的MSC培养方法详述于下面的参考文献中。重要的是要防止MSC培养物变得汇合。如果需要，可以传代MSC以避免形成融合培养物。
吸出上清液并悬浮GFP-MSC沉淀在小体积的CCM中进行细胞计数注意：建议使用活性染料如台盼蓝来区分活细胞和死细胞。 GFP-MSC通常大于95％存活。
计数细胞后，向细胞中加入45ml HBSS，并在450×g离心5-7分钟。
吸出上清液，并悬浮在HBSS中的细胞，浓度为5,000-10,000个活细胞/μl
使用小鼠在异氟烷麻醉下，使用29号针将200-300μl来自细胞悬浮液的GFP-MSC（1-3×10 6个细胞）注射到腹膜腔中。
注意：
1. 对于最佳的MSC活力，不要将细胞悬浮液与针。相反，使用移液管或简单地通过轻弹小瓶混合细胞。
2. 腹膜内注射应按照程序进行由您的机构动物护理和使用委员会或等效。
在GFP-MSC注射后立即通过轻轻按摩腹部5-10秒使细胞分散在腹膜内。
注意：要按摩腹部，用1或2个手指轻轻按压腹部。从接近注射部位的区域开始并向远侧进展。不要用力按压，以免对内脏造成创伤。
对其他小鼠重复操作。
在标准的12小时光照/黑暗周期和标准营养，容纳小鼠4-72小时注意：
1. 在72小时收集的聚集体是紧凑的并且经常粘附于组织使得它们更难获得。收集的聚集较早的时间点不太紧凑和更丰富。
2. 从腹膜收集的聚集体在大小和数量上不同。 MSC聚集体的尺寸通常在几百微米的范围内直径为2-3mm，尽管较小的聚集体由较少的聚集体组成细胞。可以收集的聚合数从腹膜逐渐减少随时间。注射后的1-3×10 ⁶ GFP-MSC，15-30个聚集体可在4h，10-15 在24小时聚集，在72小时小于10聚集
4-72小时后，通过异氟醚吸入麻醉小鼠，然后通过颈椎脱位使动物安乐死。
注意：可以执行安乐死的其他方法，但不建议使用将液体引入腹膜的方法。
使用解剖销将安乐死的小鼠稳定在橡胶或聚苯乙烯泡沫平台上（腹侧朝上）。
使用解剖钳和剪刀暴露腹膜腔（图2）。避免干扰内脏或细胞聚集体
使用具有落射荧光附件和适当的滤光片组的解剖显微镜可视化GFP信号（图2）。
注意：聚集体的定位可以在动物之间变化。在某些情况下，聚集体的可视化需要仔细重新定位内脏。

图2.在腹膜腔中形成GFP-MSC聚集体。小鼠腹膜腔的图像被揭示以显示（A）内部器官和（B）GFP-MSC聚集体。（C）在腹膜内注射2×10 6个GFP-MSC后4小时，在BALB/c小鼠的腹膜中GFP-MSC聚集体（箭头）的放大视图。
使用镊子收集聚集体，并转移到含有冰冷HBSS的50ml管注意：
1. 由于表面张力，聚集体很容易粘附在镊子上，而不需要挤压细胞周围的镊子。
2. 腹膜腔中MSC的聚集形成不是唯一的细胞的命运。 MSC将坚持某些结构腹膜。自由浮动聚集体可以与粘附体区分开细胞仔细检查。此外，可以洗涤腹膜重复用1-2ml HBSS以区分自由浮动的聚集体其通常在洗涤期间从不粘附的细胞重新定位移动。
收集感兴趣的GFP-MSC聚集物后，确保大多数细胞下降到管底部。
注意：连接到脂肪组织的聚集体将保持悬浮状态，并可以通过小心抽吸除去。没有脂肪组织的聚集体将迅速落到管的底部。
吸出HBSS上清液以去除含有脂肪组织的细胞聚集体，同时避免与细胞沉淀物接触
在HBSS中洗涤细胞并通过在400×g离心5分钟收集聚集体。
吸出上清液。聚集体现在准备用于下游应用和分析。为了分析基因和蛋白质表达的变化，可以通过在合适的裂解溶液中裂解细胞沉淀。或者，可以将聚集体转移至细胞培养皿（图3）或冷冻模具中，并冷冻用于免疫荧光应用。 MSC聚集体也可以使用胰蛋白酶/EDTA解离，并通过显微镜（图4）或流式细胞术分析。其他应用程序尚未测试。

图3.体外转移GFP-MSC聚集体。 GFP-MSC聚集体从BALB/c小鼠的腹膜转移到细胞培养皿后1小时的图像。聚集体形成坚固的微组织结构。比例尺=200μm

图4.源自腹膜聚集体的GFP-MSC的显微镜检查从腹膜收集的聚集体解离后12小时获得的细胞图像。 GFP-MSC表现为容易附着于细胞培养皿的大扁平细胞。小圆形细胞（GFP阴性）也从腹膜聚集物获得。大多数小圆细胞是宿主免疫细胞。比例尺=100μm

笔记

所有动物程序由Texas A& M Health Science Center的Animal Care and Use Committe批准并且根据美国国立卫生研究院提出的指导。
使用从人骨髓抽出物获得的MSC进行方案。用携带GFP的慢病毒报道基因转导细胞。其他类型的细胞在这个模型中没有被彻底测试
聚集体/球体将显示尺寸范围，从几百微米到2-3mm的直径，每个聚集体含有数千个孔。聚集体的大小和数量可以通过增加注射到腹膜中的细胞的数量来增加。我们通常每个动物注射1-3×10 6个 GFP-MSC，并且容易收集10-30个可变大小的聚集体/球体。
从腹膜收集的聚集体/球体通常由施用的GFP-MSC和驻留的腹膜免疫细胞组成。

食谱

完全培养基（CCM）
最小必需培养基α，1 L
高级精选胎牛血清，200 ml
青霉素 - 链霉素，12ml
100x L-谷氨酰胺，12ml
过滤灭菌（0.22μm）
储存于4°C长达1个月
使用前在水浴中预温至37°C

致谢

该方案改编自我们以前的工作（Bartosh等人，2013），并且由得克萨斯大学健康再生医学研究所Darwin J.Prockop的NIH授权（P40RR17447）支持科学中心，以及得克萨斯癌症预防和研究所（RP110553-P1）的资助。

参考文献

Bartosh，T.J.，Ylostalo，J.H.，Bazhanov，N.，Kuhlman，J.and Prockop，D.J。（2013）。将人间质干细胞/前体细胞动态压实成球体自激活半胱天冬酶依赖性IL1信号以增强分泌炎症和免疫调节剂（PGE2，TSG6和STC1）。干细胞 31（11）：2443-2456。

Bartosh，T.J.，Ylostalo，J.H.，Mohammadipoor，A.，Bazhanov，N.，Coble，K.，Claypool，K.，Lee，R.H.，Choi，H.and Prockop，D.J。（2010）。人间质基质细胞（MSC）聚集成3D球状体增强了它们的抗炎性质。 Proc Natl Acad Sci USA 107（31）：13724-13729。

Prockop，D.J.，Kota，D.J.，Bazhanov，N。和Reger，R.L。（2010）。成人干细胞/祖细胞（MSC）修复组织的演化模式。 < em> J Cell Mol Med 14（9）：2190-2199

Roddy，G.W.，Oh，J.Y.，Lee，R.H.，Bartosh，T.J.，Ylostalo，J.，Coble，K.，Rosa，R.H.，Jr.and Prockop，D.J。（2011）。远距离行动：全身性施用成人干细胞/祖细胞（MSC）可减少对角膜的炎症性损伤没有植入并且主要通过分泌TNF-α刺激的基因/蛋白6. 干细胞29（10）：1572-1579。