材料和试剂

转酮酶（TKT）。酿酒酵母（Sigma-Aldrich）
纯化的蛋白质：果糖1,6-二磷酸酶（GlpX C on）和混杂果糖1,6-二磷酸酶/Sedoheptulose 1,7-二磷酸酶（GlpX P ），以及来自B的混杂果糖1,6-二磷酸醛缩酶/沉默芽孢杆菌1,7-二磷酸醛缩酶（FBA pco和FBA p）。甲醇杯 MGA3
Sephadex G25凝胶过滤（Amersham Biosciences）
因子Xa（Novagen）
*（1M）50mM Tris-HCl（pH7.5）
*（400mM）20mM D-果糖-6-磷酸二钾盐（F6-P）（Sigma-Aldrich）
*（400mM）20mM DL-甘油醛3-磷酸盐溶液（GAP）（Sigma-Aldrich）
*（400mM）20mM二羟丙酮磷酸二锂盐（DHAP）
*（200mM）10μM焦磷酸硫胺素（TPP）（Sigma-Aldrich）
*（40mM）2mM MnCl 2溶液
*（200mM）10mM碳酸氢铵溶液（pH9.3）注意：*储备液浓度在括号中给出。

设备

Amicon Ultra-0.5离心过滤器（Millipore）
LaChromUltra HPLC系统（Hitachi）
MicroTOF-Q混合四极杆/飞行时间质谱仪（BD）
Sequant ZIC-PHILLIC柱（150×2.1mm）（Merck KGaA）

软件

Compass软件1.3（BD）

程序

体外纯化的GlpX蛋白的酶测定
1. 在SBP合成方向上的FBA活性通过使用a 含有TKT（来自酿酒酵母）的非连续，偶联酶测定，重组GlpX 和GlpX P ，以及FBA ^C和FBA ^P。甲醇池。
2. 因为E4-P不是通过购买获得的，所以E4-P在来自F6-P和GAP的TKT（5U/mg）的预反应中产生。
3. 蛋白质生产和纯化如下进行：
  1. 酶被克隆到pET16b中，其允许IPTG诱导表达 N-末端decahistidyl标签和大肠杆菌中的因子Xa切割位点大肠杆菌（大肠杆菌）BL21（DE3）。
  2. 开始用0.5mM IPTG的诱导在LB中OD OD 600为0.5-0.6。 4小时收获细胞（500ml）诱导后在20mM Tris，300mM NaCl，5mM咪唑中洗涤，和5％（vol/vol）甘油。
  3. 将沉淀的细胞在20℃下储存，直到蛋白纯化。
  4. 在通过French press裂解之前，细胞重悬于20mM Tris，300mM NaCl，5mM咪唑和5％（vol/vol）甘油，并通过加入1mM抑制蛋白酶活性苯基甲基磺酰氟（PMSF）和1mM二异丙基氟磷酸盐（DFP）。
  5. 通过在140,000x下离心1.5小时来澄清提取物 g 。
  6. Ni-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖亲和力的峰值分数用20mM Tris，300mM NaCl，100,200或400mM洗脱色谱法咪唑和5％（vol/vol）甘油，并合并使用Sephadex G25凝胶过滤和缓冲将级分脱盐在50mM Tris/HCl（pH7.5）中。
  7. 纯化后，裂解His标签通过因子Xa根据制造商的建议
4. 纯化的蛋白质在50mM Tris-HCl（pH7.5）中缓冲。的反应混合物含有50mM Tris-HCl（pH7.5），20mM F6-P，20mM GAP，20mM DHAP，10μM焦磷酸硫胺素（TPP），2mM MnCl 2和3 U/mg的每种纯化的酶（FBA缓冲液或FBA缓冲液和GlpX缓冲液或GlpX缓冲液）。
5. 通过加入TKT（5U/mg）开始反应。检测通过液相色谱 - 质谱进行产生的产物光谱（LC-MS），如下所述。
6. 测定是在50℃下进行45分钟，体积为1ml。反应为通过使用Amicon Ultra-0.5纯化含有的酶来终止离心过滤器。因此，将反应混合物取样超滤装置并将其过滤并将装置离心 14,000×g 约30分钟。从而过滤蛋白质从混合物，但剩余的成分通过。的然后上清液不含蛋白质并分析其含量。期望和结果在一个单独的描述部分。

酶测定后产物的LC-MS分析

使用LaChromUltra HPLC系统获得LC-MS数据， microTOF-Q混合四极/飞行时间质谱仪。
对于电离，质谱仪配备有电喷雾电离（ESI）源。进行通过HPLC的样品分离通过SeQuant ZIC-pHILLIC柱，使用溶剂10mM铵碳酸氢盐溶液（pH9.3）作为洗脱液A，乙腈作为洗脱液B.
注射体积为2μl，流速设为150μlmin -1 -1，并且梯度洗脱如下进行：t = 0min，80％B; t = 30分钟， 10％B; t = 35分钟，10％B; t = 40min 80％B; t = 60分钟80％B
MS检测通过ESI离子源在负电离模式下进行。施加氮作为鞘，干燥和碰撞气体。
对于内部质量校准将甲酸（0.1M）在50％（v/v）在每个MS分析中注入异丙醇。

MSMS分析通过microTOF-Q的自动MSMS模式进行。

表1. microTOFcontrol在全扫描MS模式下的参数

模式	扫描模式质量范围光谱采集包括个人资料光谱焦点	MS 50-1000 m/z 保存光谱总是非活动	离子极性滚动平均值绝对阈值峰值求和宽度：获取率	正面关闭 10 5分 1.0 Hz
资源	端板偏移量毛细管喷雾器	-500 V + 4500 V 2.0巴	干气干燥温度	8.0 L/min 180℃
转让	漏斗1 RF 漏斗2 RF	300.0 Vpp 300.0 Vpp	ISCID能量六极杆RF	0.0 eV 200.0 Vpp
四极杆	离子能量	4.0 eV	低质量	150.00m/z
碰撞单元格	碰撞能量传输时间	8.0 eV 75.0μs	碰撞RF 前脉冲存储	130.0 Vpp 5.0μs

使用Compass软件1.3分析原始数据。自动使用HPC二次方程实现内部质量校准算法。

化合物的鉴定通过比质荷比和保留时间比较MSMS模式中的碎片离子。

表2. MS/MS（MRM）模式下microTOFcontrol的其他参数

自动MSMS	前体离子	3	阈	6000 计数
转让	漏斗1 RF 漏斗2 RF	300.0 Vpp 300.0 Vpp	ISCID EnergyHexapole RF	0.0 eV 200.0 Vpp
四极杆	离子能量	4.0 eV	低质量	150.00m/z
碰撞单元格	碰撞能量传输时间	8.0 eV 75.0μs	碰撞RF 前脉冲存储	130.0 Vpp 5.0μs

有关结果/实验设置的注意事项

进行测定以通过来自甲醇毕赤酵母MGA3的纯化FBA蛋白和FBP酶蛋白的组合体外检测SBP的合成和水解。在RuMP循环的SBPase变体中，产生SBP E4-P和DHAP，并通过SBP酶脱磷酸化以产生S7-P。不幸的是，由于E4-P和SBP都不是市售的，这些化合物不能直接用于酶测定以获得 SBP合成和水解的证据。绕过这个限制，包括转酮酶的偶联不连续酶测定来自 S。酿酒酵母。
测试了底物和酶的各种组合（图1）。没有证据表明糖磷酸盐在50℃的不稳定性在没有酶的情况下获得

图1.糖磷酸中间体的测定使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）的RuMP循环。显示了糖磷酸盐的实验设置和测定中间体的RuMP循环使用液相色谱 - 质谱光谱法（LC-MS）。用于鉴定景天庚酮糖 1,7-二磷酸盐和果糖1,6-二磷酸盐，使用MS/MS。（一个）在测定中使用的底物和酶组合的方案。 X 表示在测定中的存在。（B）存在（检查标记）或不存在的所示糖磷酸盐，如通过LC-MS/MS分析所检测。（C） FBP和SBP的LC-MS光谱
E4-P和木酮糖5-磷酸（XU5-P）通过来自S的转酮酶从F-6P和GAP产生。酿酒酵母（图1，第1行）。可以从来自B的纯化的FBA缓冲液或FBA缓冲液中检测E-4P与DHAP的醛醇缩合以产生SBP。甲醇毕赤（图1，第2行）。 LC-MS/MS分析证实了SBP的身份，其显示与FBP相比30Da的预期质量移位（-CHOH-）（图1，C）。因此，这些结果表明来自B的两个FBA。甲醇阳离子作为SBAs在体外是有活性的。随后，通过使用来自B的纯化的GlpX或Supp来测定SBP水解为S7-P。甲醇杯。加入SBP的水解和S7-P的形成仅在加入GlpX（P）而不加入GlpX（C）时才发生（图1，第3,4行）。因此，对于B的主要FBPase。甲醇毕赤酵母，GlpX C ，不能在体外获得SBPase活性的证据，而GlpX p显示出作为SBPase的活性。

缩写

酶
FBA   果糖 - 二磷酸醛缩酶（EC 4.1.2.13）
TKT   转酮酶（EC 2.2.1.1）
GlpX   果糖 - 二磷酸酶（EC 3.1.3.1）
SBA   景天庚酮糖1,7-二磷酸醛缩酶（EC 4.1.2.x）
SBPase   <景天庚酮糖1,7-二磷酸酯（EC 3.1.3.37）

代谢物
F6-P 果糖-6-磷酸
FBP   果糖-1,6-二磷酸酯
GAP   3-磷酸甘油醛
DHAP   >二羟基丙酮磷酸盐
E4-P 赤藓糖4-磷酸
SBP   <景天庚酮糖1,7-二磷酸酯
S7-P <景天庚酮糖-7-磷酸 Ri5-P 核糖5-磷酸
X5P   >木酮糖5-磷酸 Ru5P   核酮糖5-磷酸

致谢

我们要感谢Trygve Brautaset博士提供的菌株。甲醇毕赤酵母MGA3和质粒pTH1; Sonja Siwiora Brenke博士提供设施，设备和技术协助，对纯化的蛋白进行尺寸排阻色谱和分子量估计。这项工作得到了SynMet的支持，SynMet是一个09-EuroSYNBIO-FP-023项目，由DFG通过授权第一部分资助。 WE 2320/2-1。

参考文献

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