材料和试剂

hTERT-RPE1细胞系（ATCC，目录号：CRL-4000）
斑马鱼（AB株）（中国斑马鱼资源中心）
DMEM/F12培养基（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11330-032）
胎牛血清（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：16000-044）
潮霉素B（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10687010）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
纯乙醇（Sinopharm Chemical Regent，目录号：10009218）
低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
Tween-20（AMRESCO，目录号：0777）
小鼠单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：T-6793）
与Alexa Fluor-546（Life Technologies，目录号：A11030）偶联的山羊抗小鼠IgG（H + L）抗体
与Alexa Fluor-488（Life Technologies，目录号：A21202）缀合的驴抗小鼠IgG（H + L）抗体
（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
Dako封固剂（Dako，目录号：s3023）
PBS（请参阅配方）
PBT（参见配方）
4％多聚甲醛（PFA）固定溶液（参见配方）
胚胎固定缓冲液（见配方）
胚胎阻断缓冲液（参见配方）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储备溶液（参见配方）
完全生长培养基（参见食谱）
无血清培养基（见配方）
75％乙醇（见配方）

设备

具有0.22μm孔径的Millex-GP过滤器单元（Millipore，目录号：SLGP033RS）
镊子（duMONT公司，目录号：0203-5/15-PO）
10cm培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353003）
12孔板（Corning，目录号：3513）
2ml Eppendorf（EP）管（Axygen，目录号：MCT-200-C）
玻璃载玻片（Fan Yi，目录号：7105P）
18mm直径的圆形盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-545-84）
石蜡膜（Parafilm M ，目录号：PM-996）
100毫升烧杯（Thermo Fisher Scientific，目录号：1201-0100）
滤纸（GE，目录号：10311611）
塑料转移移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：11387873）
（Qilinbeier，目录号：TS-8S）
Leica TCS SP5共焦显微镜，配备有63x油镜和63x NA1.2水浸物镜

程序

培养细胞中纤毛的免疫荧光标记
1. 如ATCC网站所述培养hTERT-RPE1细胞（ http://www.atcc.org/Products/All/CRL- 4000.aspx＃culturemethod ）。简而言之，细胞在具有10-12ml完全生长的10cm培养皿中生长介质（见Recipes）和介质每隔一天更换一次。细胞是当细胞浓度达到时，以1：5比率每周两次传代培养在2×10 4个细胞/cm 2和4×10 4个细胞/cm 2之间。接种物4×10 3至6× 10 ³活细胞/cm <2> 。
2. 灭菌18 mm直径通过浸泡在100ml烧杯中的75％乙醇中的圆形盖玻片晚。使用镊子和盖玻片挑选盖玻片 12孔板，每孔一个。用1ml PBS冲洗卡片三次每孔。向每个孔中加入1ml完全生长培养基，和然后加入适当等分的解离的细胞悬浮液。
3. 培养1-2天，直到细胞达到60-90％汇合。洗三次，每次1ml PBS，每次取血清，然后加1 ml无血清培养基并培养48小时以诱导纤毛形成。的培养时间和融合应由研究人员决定自己获得不同实验的最佳结果。一般来说，a 建议有效纤毛的汇合率高于60％感应
4. 固定前，将细胞置于冰上30分钟使微管不稳定，并用1ml冰冷的PBS冲洗一次好。
5. 用1ml新鲜制备的PBS中的4％PFA /孔将细胞固定在室温（RT）下10分钟。
6. 用每孔每次用1ml PBS短暂冲洗细胞三次，和用PBS中的1ml 0.5％TritonX-100 /孔透化细胞15分钟。
  注意：PFA废物应收集在适当的容器中以妥善处理。
7. 用每孔每次用1ml PBS短暂冲洗细胞三次。
8. 将细胞与PBS中的1ml 1％BSA在室温下孵育1小时
9. 用一个新的10厘米培养皿制作一个潮湿的房间湿滤纸和在纸的顶部的一片石蜡膜。使确保石蜡膜是平的。转移带有阻塞细胞的盖玻片通过使用镊子在石蜡膜上。加入100μl稀释的小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体（在含1％BSA的PBS中1:1000）并在室温下孵育2小时或在4℃下过夜
10. 用200μl1％BSA的PBS溶液洗涤细胞，每次3次，每次5分钟
11. 加入100μl稀释的二抗，山羊抗小鼠IgG（H + L）与Alexa Fluor-546偶联的抗体（在含1％BSA的PBS中1:1000）在室温下在黑暗中1小时。
12. 用200μl1％BSA的PBS溶液洗涤细胞，每次3次，每次5分钟
13. 为染色细胞核，用PBS稀释DAPI储备溶液至0.5μg/ml，加入将100μl稀释的DAPI加到每个片上，在室温下孵育1分钟
14. 用200μlPBS每次洗涤细胞三次，每次5分钟
15. 用10-20μlDako固定介质装载载玻片，如图1所示并在室温下在黑暗中干燥至少2小时。将载玻片保存在4°C。样品至少有1个月有效，但DAPI信号会扩散 1周后变暗。最好在1周内拍摄图片。
16. 用Leica TCS SP5共焦显微镜用63x油拍摄图像目的。以0.5μm的间隔和z堆叠捕获光学部分通过最大强度投影获得图像。典型的图像可以在Cao等人的图1j（2012）中找到。
斑马鱼胚胎的整体免疫荧光
1. 斑马鱼（AB菌株）在标准条件下培养和维持条件和分阶段如前所述小时后受精（hpf）（请参阅斑马鱼书： http：//zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html ）。
2. Dchorionate 斑马鱼胚胎在8体细胞阶段或24 hpf阶段通过链霉蛋白酶处理或用镊子手动。详细方法 dechorionation，请参阅斑马鱼书的第4章（ http： //zfin.org/zf_info/zfbook/chapt4/4.1.html ）。
3. 转让胚胎用塑料移液管移入2ml EP管，达到100 胚胎每个管。删除额外的水和修复胚胎与1毫升胚胎固定缓冲液在室温下2小时或在4°C过夜，轻轻摇动在振荡器上以每分钟15-20次。所有洗涤和孵化应该用轻柔的摇摆来做。添加和去除所有溶液通过使用移液器与1毫升提示。 PFA和甲醇废物应该收集在适当的容器中以妥善处置
4. 用1ml PBT短暂冲洗后，通过分级脱水胚胎甲醇/PBT系列（25％，50％，75％，100％）。在RT轻轻摇动胚胎每步5分钟。
5. 孵育胚胎在1ml 100％甲醇在-20℃。胚胎可以在-20°C储存长达1个月然后进一步染色
6. 在甲醇/PBT中使胚胎再水化（75％，50％，25％，每次5分钟，RT）。冲洗三次 PBT，每次5分钟，每管使用1ml PBT
7. 在室温下在1ml胚胎阻断缓冲液中孵育胚胎1-2小时
8. 孵育样品在4℃过夜与小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体稀释在300-500μl封闭缓冲液（1:1000）中。
  注意：建议充分孵育至少300μl。
9. 每次洗涤三次，每次10分钟，每次用1ml 0.5％Triton X-100的PBS
10. 孵育胚胎与300-500微升第二抗体，驴抗小鼠 IgG（H + L）抗体与Alexa Fluor-488偶联，在封闭中稀释缓冲液（1:1000）在4℃过夜或在室温下2小时
11. 用PBS每次1ml 0.5％Triton X-100冲洗三次，每次10分钟
12. 为染色细胞核，用PBT稀释DAPI储备溶液至0.5μg/ml，孵育胚胎与1毫升稀释DAPI每管5-10分钟，在室温。然后用1ml PBT洗涤胚胎3次，每次5分钟。胚胎是现在准备嵌入。否则，请保持染色的胚胎在PBT 在4°C长达1周
13. 嵌入胚胎在1％低熔点琼脂糖。简言之，制备H 2 O中的1％低熔点琼脂糖溶液通过在微波炉中加热。将溶液保持在管中的液体中 37℃水浴。该溶液在37℃下保持液体，但很快当冷却低于30℃时硬化。使用35毫米培养皿胚胎安装和成像。首先，在每个中加入1ml琼脂糖溶液并让其在RT凝胶。确保琼脂糖平坦，盖住整个底部的菜。通过使用塑料转移四个胚胎转移到每个培养皿的琼脂糖凝胶上。快速吸移a 小滴琼脂糖到胚胎上，并将胚胎定位在适当的角度在琼脂糖使用镊子和允许琼脂糖硬化。确保胚胎彼此远离，让你可以一个接一个地安装。 24 hpf胚胎应该横向安装显示前肾管和8体细胞期胚胎应安装到显示Kupffer的囊泡在上面。请参考图7a和图7a b，以获得正确的方向。安装胚胎应该在同一天进行检查。
14. 将2-3ml H 2 O加入到35mm孔中菜肴与安装的胚胎，并在Leica TCS SP5 MP上拍摄图像共聚焦显微镜与63x NA1.2水浸物镜。光学截面以0.5-μm间隔捕获，z-stack图像通过最大强度投影获得。可以找到典型的图像在参考文献1的图7g和j中
  
  图1.安装显微镜细胞

食谱

PBS
137 mM NaCl 2.7mM KCl
8mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
pH 7.4
高压灭菌长时间存储
PBT
PBS，含有0.1％Tween-20
4％PFA
将4g PFA溶于100ml PBS中，在搅拌下加热至60℃1小时冷却的溶液可以通过具有0.22μm孔径的Millex-GP过滤器单元过滤，并储存在-20℃。在-20°C下保存一个月，或者在准备后立即使用，建议使用。
胚胎固定缓冲区
补充有0.5％Triton X-100的PBS中的4％PFA
胚胎阻断缓冲液
2％BSA
0.5％正常山羊血清
1％DMSO 0.5％Triton X-100的PBS溶液中
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储液
将DAPI粉末溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中以制备5mg/ml储备溶液
完全生长培养基
补充有10％胎牛血清和0.01mg/ml潮霉素B的DMEM/F12培养基
无血清培养基
补充有0.01mg/ml潮霉素B的DMEM/F12培养基
75％乙醇 75ml纯乙醇与25ml H 2 O混合

致谢

该协议改编自以前的工作（Cao等人，2012; The Zebrafish Book的第4章（http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt4/4.1.html））。这项工作得到了中国国家基础研究计划（2012CB945003和2010CB912102），中国国家科学基金（30971430,30830060和31010103910）和中国科学院（XDA01010107）的支持。

参考文献

Cao，J.，Shen，Y.，Zhu，L.，Xu，Y.，Zhou，Y.，Wu，Z.，Li，Y.，Yan，X.and Zhu， miR-129-3p通过调节CP110和肌动蛋白动力学来控制纤毛聚集。 Nat Cell Biol 14（7）：697-706。