材料和试剂

疱疹病毒感染的细胞（例如，用于单纯疱疹病毒培养的Vero细胞，用于人巨细胞病毒培养的MRC5细胞）
PBS（pH 7.4）
蔗糖
NP-40
干冰
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
胎牛血清（FBS）
疱疹病毒培养基（见配方）

设备

层流罩
带冷功能离心器
超速离心机
超透明38.5ml管（装入SW28转子）（Beckman Coulter，目录号：344058）
超透明13.2ml管（装配在SW41转子中）（Beckman Coulter，目录号：344059）
Kimwipes ^TM薄纸
镊子
梯度master（Biocomp Instruments，目录号：107-201M）
手电筒
涡流
37°C水浴
带23号皮下注射针的注射器

程序

从疱疹病毒培养基中纯化病毒体
1. 当病毒培养物准备收获时，收集培养物上清液在层流罩中。我们通常使用20-30 175cm 2细胞培养瓶进行每批纯化。
  注意：从这一步开始，始终将样品保持在冰上; 所有离心机应在4℃下进行。
2. 以〜10,000×g离心15分钟以除去细胞碎片（8,000rpm， Beckman Coulter JA-14转子）。对于大容量（例如，超过200毫升每个瓶子），可能需要旋转更长或重复一次完全澄清媒体。
3. 收集上一步的上清液，在〜80,000×g下超速离心1小时以沉淀病毒颗粒（21,000rpm 与SW28转子）。
  注意：即使是较小的病毒（例如，登革病毒约50nm），以80,000xg超速离心1小时就足以沉淀下来大多数病毒颗粒。离心机以更高的速度或较长的时间可能会对一些病毒颗粒造成结构性损伤，或使颗粒难以重悬。
4. 转储上清液。使用Kimwipes ^TM薄纸卷绕在一对镊子彻底擦拭管内壁上的介质。加每个管100μlPBS，在冰上孵育过夜或至少2 h，然后通过吸移重悬浮沉淀。
  注意：将沉淀在溶液中浸泡数小时有助于松散沉淀，并使其更容易完全重悬。
5. 在SW41离心管中用〜5 ml制备连续密度梯度每个15％和50％（w/v）蔗糖的PBS溶液主机。将重悬浮液加载到密度梯度的顶部。使用另一管与蔗糖溶液平衡。
  注意：这是更好地为每种密度加载小于2ml（至多3ml）的样品梯度管。样品体积过大可能导致模糊带下一步。
6. 在80,000×g下旋转1小时（使用SW41转子，21,000rpm）。
7. 在黑暗的房间里，在密度梯度管的顶部照射手电筒清楚地看到病毒带，然后标记位置。一个好的病毒带应该是有光泽，乳白色的线，具有清晰的界面。对于疱疹病毒病毒体纯化，有时可以鉴定两条带。通常，上带包含更多具有空A-或的病毒粒子 B衣壳，而下带包含更致密的体。但多数的两个条带中的颗粒是具有DNA填充的C衣壳的病毒体。
8. 在层流罩中，去除病毒上方的梯度溶液带用1ml移液管，然后用新的移液管收集带。尝试保持体积尽可能小，以避免上下的杂质乐队。对于低浓度样品，如果没有鉴定到条带，等分梯度每2毫升。
9. 稀释病毒带（或每2ml等分）用PBS在SW41管中至全部体积管。以80,000×g离心1小时以沉淀纯化的病毒。
10. 倾倒上清液。使用Kimwipes ^TM棉纸清洁内壁如在步骤A4中。加入10-30μl（取决于沉淀的大小和期望的最终浓度）PBS，在冰上孵育至少2小时或过夜，然后通过吸移重悬浮沉淀。
11. 如果在步骤A7中没有收集到带和等分试样，检查每个样品用负染色电子显微镜来确定哪一个病毒颗粒。
  注意：对于疱疹病毒，很难区分病毒体从致密体与阴性染色EM。混合2μl的样品用等体积的1％NP-40的PBS溶液以部分溶解病毒包膜前阴性染色，则病毒体中的病毒衣壳被染色以具有容易识别的尖锐外观。
从疱疹病毒感染的细胞中纯化病毒衣壳
1. 收获疱疹病毒感染细胞达到90％的细胞病变效应。我们通常从15-20 175cm 2细胞培养瓶开始。
2. 通过在4℃下以1,000×g离心10分钟离心沉淀细胞。取出上清液。
3. 用30ml预冷的PBS洗涤沉淀，并在1,000xg下再次在4℃离心10分钟。取出上清液。
4. 通过以半最大速度涡旋5秒钟来松开沉淀。通过移液管用30ml 0.5％（w/v）NP-40的PBS重悬沉淀在冰上孵育混合物5分钟
5. 在4℃下以1,000xg离心10分钟。取出上清液。
6. 重悬沉淀（含细胞核）在30毫升PBS，并通过裂解三个循环的冷冻（干冰或-80℃，10分钟），解冻（37℃ 水浴，3-4分钟）和1分钟涡旋
7. 将裂解物保存在冰上。使溶胞产物通过23号皮下注射针至少20次。
8. 向裂解物中加入10％（w/v）NP-40的PBS溶液，使最终浓度为2％NP-40。在4℃孵育过夜。
9. 在4℃下以1500×g离心5分钟以除去大的碎片。
10. 取在SW28管中的5ml 25％蔗糖（w/v在PBS中），然后注射5ml 50％蔗糖（w/v，在PBS中），用注射器到达试管的底部制成双层蔗糖垫。轻轻加载裂解液（上清液含有衣壳）在垫上用移液管和离心机 80,000 x g 1小时。
11. 在两者的接口处收集频带蔗糖层。用PBS稀释两到三次，加载在a 连续15％至50％（w/v，在PBS中）蔗糖密度梯度。装载量少比每个梯度管2ml样品; 使用多管如果有更多样品。以80,000×g离心1小时。
12. 收集乐队的衣壳，用PBS在SW41管中稀释至管的全部体积，以80,000×g离心1小时以沉淀衣壳。对于疱疹病毒衣壳纯化，有时可以鉴定三条带。他们包含顶部，中部和底部带的A-，B-和C-衣壳分别。
13. 倒出上清液，擦去所有液体管的内壁用Kimwipes ^TM薄纸和镊子。加入10-30微升PBS，在冰上孵育至少2小时或过夜，和然后用移液器重悬沉淀
14. 通过负染色电子显微镜或冷冻电子显微镜检查样品的纯度和浓度。

食谱

疱疹病毒培养基
含有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基

致谢

该协议改编自我们先前发表的论文Dai等人（2013）。当参考协议时，也鼓励引用本原始文件。这项工作是由国家卫生研究院（NIH）授予Z.洪周（AI069015）的资助。

参考文献

Dai，X.，Yu，X.，Gong，H.，Jiang，X.，Abenes，G.，Liu，H.，Shivakoti，S.，Britt，WJ，Zhu，H.，Liu，，ZH（2013）。最小的衣壳蛋白介导基本膜蛋白pp150的结合以稳定人巨细胞病毒中含DNA的衣壳。 PLoS Pathog 9（8）：e1003525。