材料和试剂

（ 1021，Galibert et al ，2001）
注意：该协议也可应用于其他细菌。
Bio-Rad蛋白测定试剂盒I（Sigma-Aldrich，目录号：500-0001）
50mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）（每个样品5ml）
1x BugBuster试剂（Novagen，目录号：70921）
0.5 M EDTA（pH 8.0）（每个样品2.5μl）
GTP（鸟苷5'-三磷酸钠盐水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
HPLC标准：6,7-二甲基蝶呤（Schircks Laboratories，目录号：11.503）
生物素
YMB培养基（Somerville和Kahn，1983）（参见Recipes）（每个样品1个平板）
MMNH 4介质（Somerville和Kahn，1983）（参见Recipes）（每个样品13ml）
裂解缓冲液（见配方）（每个样品1ml）
脱盐缓冲液（见配方）（每个样品3ml）
RibA测定缓冲液（参见Recipes）（每个样品2.5μl）
衍生试剂（参见配方）（每个样品50μl）
HPLC流动相（参见配方）
注意：除非另有说明，所有其他化学品均获自Sigma-Aldrich。

设备

14ml Falcon管（BD Biosciences，目录号：352059）
Eppendorf 1.7ml管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-222-168）
0.22μm注射器过滤器（Microsolv Technology，目录号：58022-N04-C）
2ml Zeba Spin Desalting Columns（Thermo Fisher Scientific，目录号：87768）
微型离心机
离心机
振动器
HPLC：Waters Alliance 2695 HPLC系统连接到2475荧光检测器
XTerra MS C18柱（4.6×100mm，5μm）（Waters，部件号：186000486）

程序

细胞提取物制备
1. 成长。 meliloti在YMB板上在30℃下培养48小时。 S的最佳温度。 meliloti生长在28℃和30℃之间。
2. 接种 S. meliloti从原液YMB平板至在3ml MMNH 4培养基中的OD 600约0.1。
3. 生长细胞在30℃下48小时，250 rpm在14毫升Falcon或玻璃管
4. 将细胞稀释20倍至10ml新鲜MMNH 4培养基中，并在50ml玻璃管或烧瓶中在30℃，250rpm下生长过夜。
5. 通过在3,600×g下在4ml Falcon管中在4℃下离心15-20分钟从10ml培养物收获细胞。
6. 弃去上清液并用5 ml 50 mM Tris缓冲液在4°C洗涤细胞
7. 在4℃下将沉淀重悬在1ml裂解缓冲液中。
8. 在室温下孵育15分钟，无振荡
9. 在4℃以最大速度离心裂解液15分钟。
10. 使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测量细胞裂解物中的蛋白质浓度
酶测定
该测定方案改造自用于测定纯化的酶中的GTP环化水解酶II活性的方法（Bacher等人，1997），并且修改用于细菌提取物。
1. 按照制造商的说明书，使用2ml Zeba Spin脱盐柱对细胞裂解液进行脱盐。将柱用3ml脱盐缓冲液平衡。
2. 加入25μl的总体积为50μl的反应混合物中含有10μl5×RibA测定缓冲液，5μl10mM GTP（在超纯水中制备GTP）的上述步骤的脱盐全细胞裂解物。
3. 孵育测定在37℃下30分钟
4. 通过加入2.5μlEDTA（0.5M，pH 8.0）终止测定
5. 通过加入50μl衍生化试剂，然后在70℃孵育20分钟衍生化产物。
6. 通过在4℃下以3000xg离心10分钟来清除样品
7. 使用0.22μm注射器过滤器过滤上清液。
8. 使用具有荧光检测的HPLC分析衍生化产物
HPLC纯化和信号检测
1. 使用连接到2475荧光检测器的Waters Alliance 2695 HPLC系统在XTerra MS C18柱（4.6×100mm，5μm）上分离荧光产物。激发和发射波长分别为330nm和435nm。
数据分析
1. 通过与标准比较来量化产品。通过在HPLC上连续稀释6,7-二甲基蝶呤（0.25nM，2.5nM，25nM，0.25μm，2.5μM和25μM）获得标准曲线。
2. 归一化酶活性对蛋白质浓度和测定以nmol/min/mg蛋白质的孵育时间。
3. 在每次测定中进行三次重复。数据为平均值±S.E。的三次重复注意：GTP环化水解酶II的活性在不同生物体中不同。已经报道纯化的重组酶的活性为约0.1-120nmol/min/mg蛋白质，细菌提取物中的活性可以更低（Herz等人，2000; Kaiser等人，2002; Yurgel等人，2014 ）。

代表数据

图1.2.5μM6,7-二甲基蝶呤标准物（A）的HPLC色谱图，来自细菌提取物的GTP环化水解酶II测定的产物（B）和来自GTP环化水解酶II测定的产物与6,7-二甲基蝶呤标准物）。 HPLC流动相：10％甲醇和90％磷酸（v/v）。激发和发射波长分别为330nm和435nm。

食谱

YMB媒介根瘤菌

1 L
集中

酵母提取物
1克

甘露醇
10克
54.9 mM

Agar
15克

高压灭菌，冷却至55°C，然后加入

YMB盐I
10 ml

YMB盐II
10 ml

YMB盐I
1 L
集中

K _{2 HPO ₄} 50克
287.06 mM

NaCl
10克
171.15 mM

d H 2 O 2 960 ml

YMB盐II
1 L
集中

MgSO 4。。 O
20克
81.11 mM

d H 2 O 2 1 L

MMNH （用于根瘤菌的最小甘露醇氨培养基）

	每1 L	集中
甘露醇	10.0克	54.9 mM
NH 4 Cl	0.5克	9.34 mM
琼脂（用于平板制备）	15.0克
d H 2 O 2	970 ml

高压灭菌，冷却至55°C，然后添加：

生物素（0.2mg/ml，在50％EtOH中）	1.0 ml
硫胺素（2mg/ml），过滤灭菌	1.0 ml
Min Man Salts I	10.0 ml
Min Man Salts II	10.0 ml

Min Man Salts I

	每1 L	集中
K _{2 HPO ₄}	100克	574.12 mM
KH ₂ PO ₄	100克	734.8 mM
Na _{2 ₄}	25克	174.8 mM
d H 2 O 2	1 L

Min Man Salt II

	每1 L	集中
FeCl 3 ^。 6H <2> O	1.0 g	3.7 mM
浓HCl	调节pH至〜7.0（〜1滴）
CaCl 2 ^。 2H O	10.0克	68 mM
MgCl 2 ^。 6H <2> O	25.0克	123 mM
d H 2 O 2	1 L
高压灭菌器

裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM MgCl 2/
1mM三（羟丙基）膦
1x BugBuster试剂
脱盐缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 1mM三（羟丙基）膦
10％甘油
RibA测定缓冲液
100mM Tris-HCl（pH8.5）缓冲液
5mM MgCl 2/
5mM二硫苏糖醇（DTT）
衍生试剂
1％（v/v）二乙酰基 15％（w/v）三氯乙酸
HPLC流动相
10％（v/v）甲醇
90％磷酸（27mM磷酸）

致谢

该方案得自Yurgel等人，2014年。该工作得到华盛顿州立大学的农业研究中心（WNP-00773）的支持，并授予DE-FG0396ER20225 Vol。 27，No.5,2014/445，来自美国能源部的能源生物科学计划，并授予NSF-MCB 1052492给S.Rajamani。这项活动部分资助了华盛顿州立大学农业，人类，自然资源科学和生物密集型农业和有机农业学院农业研究中心的新兴研究问题内部竞争性拨款（BIOAg）内部竞争性拨款从维持中心农业和自然资源（CSANR）在华盛顿州立大学S. Yurgel。我们感谢M. Kahn的讨论和华盛顿州立大学生物技术和生物分析实验室的测序支持。

参考文献

Bacher，A.，Richter，G.，Ritz，H.，Eberhardt，S.，Fischer，M。和Krieger，C。（1997）。核黄素的生物合成：GTP环化水解酶II，脱氨酶和还原酶方法Enzymol 280：382-389。
Galibert，F.，Finan，TM，Long，SR，Puhler，A.，Abola，P.，Ampe，F.，Barloy-Hubler，F.，Barnett，MJ，Becker，A.，Boistard，P.，Bothe G.，Boutry，M.，Bowser，L.，Buhrmester，J.，Cadieu，E.，Capela，D.，Chain，P.，Cowie，A.，Davis，RW，Dreano，S.，Federspiel， NA，Fisher，RF，Gloux，S.，Godrie，T.，Goffeau，A.，Golding，B.，Gouzy，J.，Gurjal，M.，Hernandez-Lucas，I.，Hong，A.，Huizar， L.，Hyman，RW，Jones，T.，Kahn，D.，Kahn，ML，Kalman，S.，Keating，DH，Kiss，E.，Komp，C.，Lelaure，V.，Masuy， Palm，C.，Peck，MC，Pohl，TM，Portetelle，D.，Purnelle，B.，Ramsperger，U.，Surzycki，R.，Thebault，P.，Vandenbol，M.，Vorholter，FJ，Weidner，S 。，Wells，DH，Wong，K.，Yeh，KCand Batut，J。（2001）。豆科植物共生菌的复合基因组 Sinorhizobium meliloti 。科学 293（5530）：668-672。
Herz，S.，Eberhardt，S。和Bacher，A。（2000）。核黄素在植物中的生物合成。拟南芥的ribA基因确定了双功能GTP环化水解酶II/3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶。
53（7）：723-731。
Kaiser，J.，Schramek，N.，Eberhardt，S.，Puttmer，S.，Schuster，M。和Bacher，A。（2002）。维生素B2的生物合成 Eur J Biochem 269 21）：5264-5270。
Somerville，J.E。和Kahn，M.L。（1983）。克隆来自苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）的谷氨酰胺合成酶I基因。 156（1）：168-176。
Yurgel，SN，Rice，J.，Domreis，E.，Lynch，J.，Sa，N.，Qamar，Z.，Rajamani，S.，Gao，M.，Roje，S。和Bauer，。中华根瘤菌黄素分泌和细菌 - 宿主相互作用：双功能RibBA蛋白。 Mol Plant Microbe Interact 27（5）：437-445。