材料和试剂

设备

软件

程序

将每个VLP和重组病毒样品稀释到PBS或柠檬酸盐 - 磷酸盐缓冲液中，以获得0.1-0.24mg/ml之间的浓度。在每次运行中包括浓度为0.24mg/ml的溶菌酶样品作为阳性对照。改变样品的浓度以在仪器上获得相似的荧光强度
将浓缩的5,000x SYPRO Orange的等分试样储存在-20℃，并在每次反应设置之前温和地完全解冻至室温。
将1μlSYPRO Orange稀释到100μl蒸馏水中，得到1％50x工作液。由于SYPRO Orange是光敏感的，工作材料用铝箔覆盖并保持在黑暗中，直到分发之前。
将2.5μl工作母液加入到上述每个样品中。如果在4小时后不使用，剩余的工作油料（如果有的话）被丢弃
将样品保存在铝箔覆盖的盒子中以防止暴露于光，直到它们转移到qPCR机器中
该测定在温度从30℃升至99℃，每1分钟增加1度进行
数据导出为文本（.csv）文件，并传输到Microsoft Excel 2007中进行数据分析

代表数据

通过将所有样品除以该样品中最大记录强度，将来自所有样品的原始强度数据标准化至100％的上限。数据绘制在X轴上的温度和Y轴上的归一化强度
原始数据还用于计算荧光每温度变化（dF/dT）的变化。将由该计算得到的最大值定义为熔融温度（Tm）。这可以通过取连续荧光读数之间的差除以测量之间的温度变化来完成。然后可以相对于温度绘制强度变化（dF）。然后可以从列表中可视化或选择最大值。如这里所述，温度步长为1度。

图1.显示两个腺相关病毒样品和溶菌酶阳性对照的代表性图像。 x轴显示温度，y轴显示标准化为100％的荧光强度。 >

笔记

SYPRO橙色可以用300nm的UV光或使用472nm的可见光激发。发射测量为570nm
qPCR机器具有用于SYPRO Orange的有限的一组过滤器。尽管在470nm下可以进行激发，但是在550nm的发射波长下收集光谱。尽管这比最佳发射波长小20nm，但观察到的峰强度为在570nm观察到的峰强度的〜50％。更重要的是，信噪比非常高，从而意味着高质量的数据
从差示扫描量热法获得的互补数据（数据未显示）也与从我们的方法获得的互补数据精确相关，从而进一步增强我们的数据的价值（Rayaprolu等人，2013）。
在机器的转子上有36个空位。将仅含有缓冲溶液和染料的PCR管用作阴性对照。对于该样品被识别为阴性对照，该PCR管需要放置在转子中的第一位置。第二位置由仅含有不含蛋白质或染料的缓冲液的管占据。这使我们能够确定缓冲溶液是否有助于荧光强度。第三位置含有溶菌酶反应等分试样（如过程部分中所述）。这作为一个积极的控制。溶菌酶的熔融温度已经在文献中有详细记载。我们将从DSF获得的结果与以前记录的结果进行比较。最初测试了多于一种浓度的溶菌酶以确认解链温度和荧光线性。

食谱

柠檬酸盐 - 磷酸盐缓冲液
43.6％0.2M磷酸二钠
6.4％的0.1M柠檬酸
50mM氯化钠
检查pH是否为7.0，如果没有，用盐酸或氢氧化钠调节至pH7.0 用水补足所需体积

致谢

该工作由来自国立卫生研究院（NIH）的授权R01 AI081961-01A1资助。该协议改编自Rayaprolu等人（2012）。

参考文献

Rayperro，V.，Kruse，S.，Kant，R.，Venkatakrishnan，B.，Movahed，N.，Brooke，D.，Lins，B.，Bennett，A.，Potter，T.，McKenna， Agbandje-McKenna，M.和Bothner，B。（2013）。腺相关病毒衣壳稳定性和动力学的比较分析 J Virol 87（24）：13150-13160。
Vedadi，M.，Niesen，FH，Allali-Hassani，A.，Fedorov，OY，Finerty，PJ，Jr.，Wasney，GA，Yeung，R.，Arrowsmith，C.，Ball，LJ，Berglund， Hui，R.，Marsden，BD，Nordlund，P.，Sundstrom，M.，Weigelt，J。和Edwards，AM（2006）。化学筛选方法，用于鉴定促进蛋白质稳定性，蛋白质结晶和结构测定的配体。 Proc Natl Acad Sci USA 103（43）：15835-15840。
Yeh，A.P.，McMillan，A。和Stowell，M.H。（2006）。快速简单的蛋白质稳定性筛选：应用于膜蛋白。 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62（Pt 4）：451-457
http ：//www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence- spectraviewer.html＃product = S6650 。