图1.通过DAG激酶将DAG酶促转化为磷脂酸。

材料和试剂

细胞（〜2×10 6个细胞）
辛基-β-D-葡萄糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：O8001）
心磷脂（Sigma-Aldrich，目录号：C5646）
二亚乙基三胺五乙酸（DETAPAC）（Sigma-Aldrich，目录号：D6518）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
EGTA（Boston Bio Products，目录号：BM-151）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
DAG激酶（Sigma-Aldrich，目录号：D3065）
γsup 33 -ATP（PerkinElmer，目录号：NEG302H001MC）
DAG（Avanti Polar Lipids）
磷脂酸（Sigma-Aldrich，目录号：P9511）
氯仿（Thermo Fisher Scientific，目录号：C298-50）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1105）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
N 2气体（Middlesex Gases& Technologies）
丙酮（Thermo Fisher Scientific，目录号：S70090）

设备

涡流
离心机
薄层色谱（TLC）（Whatman，目录号：4860-820）设备（板，显影槽）
Phospho扫描仪（例如，Fujifilm Corporation，型号：BAS-2500）
磷光成像屏幕（例如，Fujifilm Corporation，型号：BAS-MS）

程序

在开始测定前准备以下溶液
1. 增溶缓冲液：在1mM二亚乙基三胺五乙酸（1mM DETAPAC，pH 7.0;用NaOH调节pH）中的7.5％（w/v）辛基-β-D-葡萄糖苷和5mM心磷脂。
2. 1mM二亚乙基三胺五乙酸（1mM DETAPAC，pH 6.6;用NaOH调节pH）。
3. 2x反应缓冲液：100mM咪唑HCl，pH 6.6,100mM NaCl，25mM MgCl 2和2mM EGTA。
4. 100mM DTT的H 2 O（新鲜制备）
样品制备和总脂质提取
1. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞（约2×10 6个），并根据Bligh和Dyer（Bligh等人，1959）提取脂质。
2. 在N 2缓慢流下干燥氯仿/甲醇相。
DAG激酶测定
该测定法改编自Preiss等人（1986）。从4开始的步骤需要在放射性工作认证的实验室区域进行，并且应遵循正确的实验室实践。
1. 通过剧烈涡旋20秒溶解干燥脂质在40μl增溶缓冲液中。
2. 在室温下孵育溶解的脂质10分钟。
3. 将样品保持在冰上5分钟，加入100μl的2x反应缓冲液，4μl的100mM DTT和20μl的E。大肠杆菌DAG激酶，同时将样品保持在冰上。
4. 通过加入通过稀释在20μl的1mM DETAPAC（pH 6.6）中制备的3μCi[γ-36] -ATP来引发反应。
5. 在短暂涡旋后，在25℃下孵育反应30分钟。
6. 通过将管保持在冰上停止反应，如上所述再提取和干燥脂质
7. 将干燥的脂质溶解在约50μl氯仿/甲醇（2/1，v/v）中
8. 将脂质提取物与脂质标准品（磷脂酸和DAG）一起应用于TLC板上
9. 将TLC板放置在含有约75ml丙酮的TLC室中30分钟
10. 干燥TLC板并进一步在氯仿/甲醇/乙酸（65/15/5，v/v/v）溶液中展开TLC板。
11. 使用吹风机干燥TLC板并将其暴露于磷光成像屏
12. 通过使用BAS-2500扫描仪扫描磷光成像屏幕来检测放射性标记的脂质

致谢

该协议改编自Strijbis等人（2013）。这项工作的资金来自国家卫生研究院（GM040266; GRF和F32 AI729353; VKV），（H.L.P.），科学研究组织（KS，MDW，FGT）和粘土博士后研究金（KS）。

参考文献

Bligh，E.G。和Dyer，W.J。（1959）。总脂质提取和纯化的快速方法 Ca 37（8）：911-917。
Preiss，J.，Loomis，C.R.，Bishop，W.R.，Stein，R.，Niedel，J.E。和Bell，R.M。（1986）。定量测量血小板，肝细胞和ras和sis中存在的sn-1,2-二酰基甘油转化的正常大鼠肾细胞。 Biol Chem 261（19）：8597-8600。

Strijbis，K.，Tafesse，FG，Fairn，GD，Witte，MD，Dougan，SK，Watson，N.，Spooner，E.，Esteban，A.，Vyas，VK，Fink，GR，Grinstein，，HL（2013）。 Bruton的酪氨酸激酶（BTK）和Vav1有助于白色念珠菌的Dectin1依赖性吞噬作用/em> 9 9（6）：e1003446。