材料和试剂

新鲜植物组织
Nucleon PhytoPure DNA提取试剂盒（通用电气公司，目录号：RPN8510）
GeneMate LE琼脂糖（BioExpress，目录号：E-3120）
Biodyne Plus Nylon Membrane（Pall，目录号：60406）
Wizard DNA Clean-Up System（Promega，目录号：A7280）
DIG-High Prime DNA标记和检测起始试剂盒II（Roche Diagnostics，目录号：11585614910）
X光片
盐水柠檬酸钠（SSC）
净化溶液（见配方）
变性溶液（参见配方）
中和解决方案（参见配方）
1x TAE缓冲区（请参阅配方）

设备

用于凝胶和膜处理的塑料容器
离心机（Eppendorf，型号：5415R）
分光光度计（Shimadzu，型号：BioSpec-nano）
Shaker（BIO CRAFT，型号：BC-700）
真空转印装置（BIO CRAFT，型号：BS-31）
杂交烘箱和UV交联剂（UVP，型号：HybriLinker HL-2000）
真空浓缩器（Savant ^TM，型号：DNA SpeedVac DNA110）
杂交孵育器（TAITEC，型号：HB-80）

程序

使用PhytoPure根据用户手册在液氮中研磨植物组织并提取基因组DNA 注意：
1. 异丙醇在-20℃下沉淀至少30分钟。
2. 其他植物基因组DNA分离程序是可以接受的。
通过分光光度计和/或琼脂糖凝胶电泳检查分离的基因组DNA的数量和质量注意：我们使用具有OD <260> 280> 1.8。
将1-5μg基因组DNA加载到2％琼脂糖凝胶上注意：还装载100-bp梯形标记以估计片段化DNA的分子量。
注意：虽然我们从未尝试过，但是可以检测到较小量（<1μg）的DNA。
在50伏电泳，在1x TAE缓冲液中电泳2小时注意：我们使用110 x 100 x 6 mm的琼脂糖凝胶。
溴化乙锭染色和暴露于紫外光。
注意：检查凝胶中分子标记带的位置。
将琼脂糖凝胶放入脱盐溶液（250 ml）中的塑料容器中，在摇床上轻轻搅拌10分钟（或直到溴酚蓝变黄）。注意：脱嘌呤溶液部分水解大DNA片段以帮助充分转移DNA片段。
通过dH 2 O冲洗凝胶三次。
在变性溶液（250ml）中处理凝胶15分钟两次注意：变性溶液使双链DNA变性以进行有效杂交。
通过dH 2 O冲洗凝胶三次。
在中和溶液（250ml）中处理凝胶15分钟两次注意：中和溶液会中和凝胶的pH值。
将凝胶放置在真空转移装置上，用Biodyne Plus膜预浸在20x SSC缓冲液中，根据制造商的说明进行转移2小时。
注意：使用20x SSC的滤纸是可选的。
通过UV交联将DNA固定到膜上，并用灭菌的dH 2 O洗涤膜。
注意：
1. 在暴露于UV之前，将膜包裹在Saran Wrap中。
2. UV能量剂量为120mJ/cm ²。
干燥膜。
注意：这种干膜可以在4℃下保存。
DIG标记的探针的制备。
1. 用50单位的限制酶在37℃消化2μg基因组DNA 12小时注意：4基刀具（例如HaeIII，MspI）是适合的。
2. 使用Wizard DNA Clean-Up System纯化DNA。
  注意：酚 - 氯仿萃取和乙醇沉淀是可选的。
3. 使用真空浓缩器干燥纯化的DNA溶液
4. 用16μl无菌dH 2 O溶液分解DNA
5. 煮沸DNA样品10分钟，冰上冷却保持变性的单链DNA
6. 加入4μlDIG-High Prime（5x浓度）并混合
7. 在37℃下孵育20小时。
8. 通过加热至65℃10分钟停止反应
9. 反应混合物可储存在-20℃下
将膜置于杂交瓶中，进行至少1小时的预杂交，并在杂交炉中在44℃下使用DIG Easy Hyb杂交过夜。
注意：在上述探针的情况下，将2-3μl探针加入到5ml杂交缓冲液中。
将膜用1×SSC和0.2％SDS在68℃下在杂交孵育箱中洗涤两次15分钟，以塑料容器。
注意：尽可能快地摇动容器，确保膜保持移动，并且每次都应更换溶液。
用杂交孵育器在68℃下用0.1×SSC和0.5％SDS将膜洗涤到塑料容器中20分钟两次。
根据DIG-High Prime DNA标记和检测启动器Kit II用户手册进行检测。
将化学发光信号暴露于X射线胶片或成像器。 DNA梯状可视化（图1）

图1.检测DNA梯状。将拟南芥野生型（WT）和ire1a/b 突变体的幼苗用衣霉素/ml）48小时。（A）从幼苗的地上部分提取的基因组DNA的溴化乙啶染色。 M，100 bp梯形标记。（B）与DIG-标记的Hae III/MspI-消化的拟南芥基因组DNA探针杂交的（A）中的琼脂糖凝胶的Southern印迹。< br /

食谱

净化溶液（500ml）
将25ml 5N HCl（0.25N）与475ml dH 2 O混合在室温下贮存
变性溶液（500ml） 10g NaOH（0.5N）
43.83g NaCl（1.5M）将dH <2> O添加到500ml
在室温下贮存
中和溶液（500ml） 30.3g Tris（0.5M）
87.66g NaCl（3N）
将dH 2加到450ml
中通过浓缩将pH调节至7.5。 HCl
将dH <2> O添加到500ml
在室温下贮存
1x TAE缓冲区
40mM Tris-乙酸盐 1mM EDTA

致谢

该协议改编自Mishiba等人（2013）。

参考文献

Mishiba，K.，Nagashima，Y.，Suzuki，E.，Hayashi，N.，Ogata，Y.，Shimada，Y.and Koizumi，N。（2013）。 IRE1中的缺陷增强细胞死亡，并且不能降解拟南芥中编码分泌途径蛋白的mRNA unfolded protein response。 Proc Natl Acad Sci USA 110（14）：5713-5718。
Wyllie，A.H。（1980）。糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与内源性内切核酸酶激活有关。 284（5756）：555-556。