材料和试剂

工程酿造酿酒酵母菌株，其中将ZsGreen 报道基因整合到基因组中（IMFD-72ZsD：MATahis3Δlleu2/em>Δem1 0 met15 0 ura3 0 sst2 Δ:: AUR1-C ste2 Δ :: Δgpa1Δ :: Gi3tp ）（中村等人，2013）
注意：ZsGreen的表达由信号响应性FIG1启动子控制。
将多拷贝表达质粒（含有PGK1启动子，2μ起点和 MET15 标记的pGK421）（Togawa等，编码感兴趣的GPCR（例如，生长抑素受体亚型-5（SSTR5））;生长抑素受体亚型-2（SSTR2）;或神经降压素受体I型（NTSR1）]（Ishi等人，2012; Ishii等人，2014）。
GPCR配体[例如，生长抑素（SST）（Merck KGaA，Calbiochem ，目录号：51110-01-1）和神经降压素（NTS）（Merck KGaA，Calbiochem& sup>®，目录号：39379-15-2）]
10mg/ml载体DNA（Takara Bio Company，Clontech，目录号：630440）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris缓冲盐酸）（Nacalai Tesque，目录号：35409-45）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA 2Na·2H 2 O）（Nacalai Tesque，目录号：15111-45）
1M盐酸（HCl）（Nacalai Tesque，目录号：37314-15）
乙酸锂二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：L6883）
乙酸（Nacalai Tesque，目录号：00212-85）
聚乙二醇（PEG）＃4000（Nacalai Tesque，目录号：28221-05）
DMSO（Nacalai Tesque，目录号：13445-74）
BD FACSFlow鞘液（BD，目录号：342003）
浸没油（奥林巴斯，目录号：IMMOIL-F30CC）
蒸馏水（dH 2 O）
酵母提取物（Nacalai Tesque，目录号：15838-45）
蛋白胨（BD，目录号：211677）
D-葡萄糖（Nacalai Tesque，目录号：16806-25）
无氨基酸的酵母氮源（YNB）（BD，目录号：291940）
L-组氨酸（Nacalai Tesque，目录号：18116-92）
L-亮氨酸（Nacalai Tesque，目录号：20327-62）
尿嘧啶（Nacalai Tesque，目录号：35824-82）
3 - （N，N-吗啉代）-2-羟基丙磺酸（Mopso）（Nacalai Tesque，目录号：23421-64）
氢氧化钠（NaOH）（Nacalai Tesque，目录号：31511-05）
琼脂（Nacalai Tesque，目录号：01028-85）
10 x TE缓冲区（参见配方）
10 x LiAc（参见配方）
50％PEG（参见配方）
TE/LiAc溶液（参见配方）
LiAc/PEG溶液（参见配方）
YPD介质（参见配方）
补充有组氨酸，亮氨酸和尿嘧啶的合成葡萄糖（SD）选择性培养基（参见配方）
补充有组氨酸，亮氨酸和尿嘧啶的SDM71选择性培养基（参见Recipes）

设备

16.5×105mm试管（AGC Techno Glass，目录号：9820TST16.5-105NP）
10-ml锥形瓶（AGC Techno Glass，目录号：4980FK10）
2-ml微量离心管（WATSON，目录号：332-720℃）
1.5-ml微量离心管（WATSON，目录号：131-815C）
96孔细胞培养板（Corning，目录号：3596）
微孔板密封胶带（AS ONE Corporation，目录号：1-6774-05）
具有2位帽的12.5×75mm试管（B& M Equipment，目录号：222-2036-050）
显微镜载玻片（Matsunami Glass，目录号：S091150）
18×18mm盖玻片（Matsunami Glass，目录号：C218181）
离心机（Eppendorf，型号：MiniSpin plus）
块培养箱（Astec Industries，型号：BI-516C）
振荡用于试管和锥形瓶（TAITEC，型号：BR-43FL）的培养箱
摇动用于96孔细胞培养板（TAITEC，型号：M∙BR-022UP）的培养箱。
分光光度计（Shimadzu，型号：UVmini-1240）
BD FACSCanto II流式细胞仪（BD）
荧光显微镜（Keyence公司，型号：BZ-9000）
100x物镜（尼康公司，型号：CFI Plan Apo VC 100x H）
BZ滤波器立方体（激发滤波器，吸收滤波器，分色镜）（Keyence公司，型号：OP-66836GFP-BP）

软件

BD FACSDiva软件（v5.0）（BD）

程序

酵母转化
使用乙酸锂方法进行转化（Gietz等人，1992）。
1. 在具有单菌落的16.5×105mm试管中接种5ml YPD培养基。酿酒酵母菌株IMFD-72ZsD
2. 将培养物在30℃，150℉条件下振荡培养过夜注意：振荡培养箱（TAITEC，型号：BR-43FL）。
3. 转移2毫升细胞培养物到2毫升微量离心管，并通过在室温下以3,000rpm离心5分钟沉淀细胞。
4. 除去上清液并用1ml灭菌的dH 2 O洗涤细胞
5. 通过在室温下以3,000rpm离心5分钟来沉淀细胞
6. 除去上清液，并将细胞重悬于1.5ml TE/LiAc溶液中
7. 等分100微升的酵母悬浮液到新鲜的1.5毫升微量离心管
8. 向每个管中加入500ng质粒DNA（pGK421-SSTR5，-SSTR2或-NTSR1）和20μg载体DNA。
  注意：在使用载体DNA之前，在95℃变性5分钟，然后在冰上快速冷却。
9. 向每个管中加入600μlLiAc/PEG溶液，并高速涡旋10秒以混合
10. 在30℃下孵育细胞悬浮液30分钟
11. 加入70μl的DMSO。通过温和倒置混合。不要涡旋。
12. 在42℃热冲击15分钟。
13. 在室温下以14,000rpm离心细胞悬浮液5秒。完全除去上清液。
14. 将细胞重悬于0.5ml 1×TE缓冲液中
15. 在每个SD选择性琼脂平板上铺100微升细胞悬液注意：由于酵母菌株具有his3Δleu2Δmet15Δura3Δ等位基因并且质粒具有MET15作为选择标记，因此选择培养基需要补充组氨酸，亮氨酸和尿嘧啶。
16. 在30°C孵育平板，直到菌落出现（一般，2-4天）
GPCR信号转导测定
1. 在具有阳性转化体的单个菌落的16.5×105mm试管中接种5ml SD选择培养基。
2. 将培养物在30℃，150℉条件下振荡培养过夜注意：振荡培养箱（TAITEC，型号：BR-43FL）。
3. 测量酵母培养物的OD <600> 注意：分光光度计
4. 将培养的细胞转移到10ml新鲜的SD选择培养基中，在10ml锥形瓶中，初始OD600为0.03。
5. 进一步在30℃下以150rpm的旋转振荡温育培养物18小时注意：振荡培养箱（TAITEC，型号：BR-43FL）。
6. 转移2毫升细胞培养物到2毫升微量离心管，并通过在室温下以3,000rpm离心5分钟沉淀细胞。
7. 除去上清液并用1ml灭菌的dH 2 O洗涤细胞
8. 通过在室温下以3,000rpm离心5分钟来沉淀细胞
9. 除去上清液并将细胞重悬于〜400μl灭菌的dH 2 O中。
10. 测量细胞悬浮液的OD 600，然后将其稀释至OD 600的10倍。
  注意：分光光度计。
11. 将10μl所得细胞悬浮液（给予OD 600为1）加入到96孔簇培养皿的每孔80μl新鲜SDM71选择培养基中。
12. 向每个孔中加入10μl10倍浓度的配体（SST或NTS）或灭菌的dH 2 O（无配体对照）。
  注意：建议最终浓度〜10μM配体（溶解于无菌dH 2 O中稀释）。< em>
13. 用密封带密封96孔簇皿。
14. 孵育皿在30℃下4小时，在150 rpm的摇动。孵育后，使用流式细胞仪或荧光显微镜（见下文）测量绿色荧光注意：摇动培养箱（TAITEC，型号：M∙BR-022UP）。
  
  流式细胞术分析
  1. 稀释细胞培养在1毫升鞘液中的试管与2位帽
  2. 使用装备有530/30nm带通滤光片的BD FACSCanto II流式细胞仪测量从10,000个细胞发射的绿色荧光信号。
  3. 分析数据并使用BD FACSDiva软件评估10,000个细胞的平均ZsGreen荧光
  荧光显微镜成像
  1. 转移细胞培养物到1.5毫升微量离心管，并通过在室温下以3,000rpm离心5分钟沉淀细胞。
  2. 除去上清液，用100μl灭菌的dH 2 O洗涤细胞
  3. 通过在室温下以3,000rpm离心5分钟来沉淀细胞
  4. 除去上清液并将细胞重悬于10μl灭菌的dH 2 O中
  5. 点7玻璃载玻片上的细胞悬液，并在该点上盖上盖玻片
  6. 使用装备有100倍物镜或等效物的BZ-9000荧光显微镜观察细胞，并获得具有用于激发的470/40带通滤波器和用于发射的535/50带通滤波器的绿色荧光图像。
    注意：100x物镜应浸在油中。

代表数据

图1.外源性添加SST后在酵母中产生的人SSTR5的激活。用pGK421（mock）或pGK421-SSTR5转化酵母菌株IMFD-72ZsD。所有转化体在SD培养基中生长18小时。然后将细胞在具有或不具有10μMSST的SDM71培养基中孵育另外4小时。 A.通过流式细胞术测量10,000个细胞的ZsGreen荧光。数据显示为一式三份样品的平均值±SD。 B.使用或不使用10μMSST的IMFD-72ZsD/SSTR5的ZsGreen荧光的可视化。使用荧光显微镜上的100x物镜获得图像。转载自Ishii 等人的许可。（2012）。

笔记

在干净的长凳上工作。

食谱

10×TE缓冲液（200ml） 2.4克Tris-HCl（0.1M） 0.74g EDTA 2Na·2H 2 O（10mM）溶于175ml dH 2 O中用1M HCl调节pH至7.5 用dH 2 O调节体积至200ml
高压灭菌
灭菌
10x LiAc（200ml） 20.4g乙酸锂二水合物（1M）溶于175ml dH 2 O中用稀乙酸调节pH至7.5 用dH 2 O调节体积至200ml
高压灭菌
灭菌
50％PEG（200ml） 100g PEG＃4000
将dH ₂ O加到200ml
中高压灭菌
灭菌
TE/LiAc溶液（1.5ml） 150μl10×TE缓冲液
150μl10×LiAc
1.2ml灭菌的dH 2 O
注意：在使用前准备新鲜食物。
LiAc/PEG溶液（1ml） 800μl50％PEG
100μl10×TE缓冲液
100μl10×LiAc
注意：在使用前准备新鲜食物。
YPD培养基（1L） 10g酵母提取物
20克蛋白胨
20克D-葡萄糖
将dH <2> O添加到1 L
高压灭菌
灭菌
补充有组氨酸，亮氨酸和尿嘧啶（1L）的SD选择培养基 20克D-葡萄糖
6.7g无氨基酸的酵母氮源（YNB）
20mg L-组氨酸
60 mg L-亮氨酸
20mg尿嘧啶
将dH <2> O添加到1 L
高压灭菌
灭菌注意：对于实心板，向培养基中加入2％琼脂。
补充有组氨酸，亮氨酸和尿嘧啶（1L）的SDM71选择培养基 20克D-葡萄糖
1.7g无氨基酸的酵母氮源（YNB）
45g 3 - （N，N-吗啉代）-2-羟基丙磺酸（Mopso）
20mg L-组氨酸
60 mg L-亮氨酸
20mg尿嘧啶
溶于800ml dH 2 O中用10N NaOH将pH调节至7.1 使用dH <2> O调节音量至1 L
过滤灭菌

致谢

该协议改编自以前发表的论文Nakamura等人（2013）。这项工作得到了来自日本促进科学协会的JSPS研究员（23∙2292）和青年科学家（B）（26820362）的助学金的支持。

参考文献

Gietz，D.，St Jean，A.，Woods，R.A。和Schiestl，R.H。（1992）。改进的完整酵母细胞高效转化方法核酸研究 20（6）：1425.
Ishii，J.，Moriguchi，M.，Hara，K.Y.，Shibasaki，S.，Fukuda，H.and Kondo，A。（2012）。改进了酵母细胞中激动剂介导的Gαi特异性人G蛋白偶联受体信号传导的鉴定流式细胞术。 Anal Biochem 426（2）：129-133
Ishii，J.，Oda，A.，Togawa，S.，Fukao，A.，Fujiwara，T.，Ogino，C.and Kondo，A。（2014）。人类神经降压素受体的微生物荧光传感 1型使用Gα工程酵母细胞。 Anal Biochem 446：37-43。
* Nakamura，Y.，Ishii，J.and Kondo，A。（2013）。使用Zoanthus的明亮荧光监测系统绿色荧光蛋白（ Cy5）用于微生物酵母细胞中的人G蛋白偶联受体信号传导。 8（12）：e82237。 >
Togawa，S.，Ishii，J.，Ishikura，A.，Tanaka，T.，Ogino，C.and Kondo，A。（2010）。人类生长抑素受体亚型的氨基末端结构域上第13和26位的天冬酰胺残基的重要性， 5在信号传导中。 147（6）：867-873