材料和试剂

Hela细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
siRNA文库（例如人siGENOME SMARTpool Druggable Genome siRNA文库0.5nmol）（Thermo Fisher Scientific，目录号：G-004605-05）
5x siRNA缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：B-002000-UB-100）
无RISC（RSCF）对照siRNA（20nmol）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D-001220-01-20）
加扰的非靶向对照siRNA（20nmol，人）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D-001206-13-20）
测定特异性对照siRNA
胎牛血清（FBS）（LabTech，目录号：FCS-SA-10454）
青霉素：链霉素（每种5,000单位/ml）（Lonza，目录号：DE17-603E）
1x胰蛋白酶-EDTA液体（0.05％胰蛋白酶，0.53mM EDTA-4Na）（Life Technologies，目录号：25300096）
不含镁或钙的磷酸盐缓冲盐水（Lonza，目录号：17-516F）
DMEM 4.5g葡萄糖/升与L-谷氨酰胺和丙酮酸钠（Lonza，目录号：BE12-604F）
1×DMEM/F12 1:1（15mM HEPES + L-谷氨酰胺，无酚红）（Life Technologies，目录号：11039021）
汉克平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：HYC-001-181W）
Dharmafect 1siRNA转染试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：T-2001）
无菌DNase和无RNase蒸馏水（Life Technologies，目录号：10977-049）
乙醇（稀释于无菌RNase和无DNase的水中）
CellTiter-Blue细胞活力试剂（Promega Corporation，目录号：G8081）
HSV-1-eGFP报道病毒（Arthur等人，2001）
生长培养基（参见食谱）
转染培养基（见配方）

设备

用于机器人液体处理器的移液器吸头（Axygen Zymark200μl无菌吸头）（VWR International，目录号：AXYGZT-200-L-R-S）
用于96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB0752）的聚苯乙烯板盖
用于存储微板的铝热封膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0559）
粘合板密封件（Starlab，目录号：E2796-9793）
384-孔培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0781）
黑色384孔透明平底，无菌，组织培养处理的平板（VWR International，目录号：734-1640）
75cm 2过滤盖组织培养烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：C7106）
175cm 2过滤盖组织培养烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：C7481）
50ml离心管（Corning，产品编号：430290）
一次性血细胞计数器（KOVA Glasstic slide 10 with counting grid）（HYCOR Biomedical，目录号：87144E）
II类微生物安全柜
加湿的细胞培养孵育器（37℃，5％CO 2）
移液器辅助（Alpha实验室，目录号：4-131-201-E）
离心机（例如：Eppendorf，目录号：5811-000.010）
光学显微镜
8通道多通道移液管（2-10μl体积）（Thermo Fisher Scientific，目录号：4661000）
Multidrop 384试剂分配器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5840150）
Multidrop 384标准管分配盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：24072670）
RapidPlate 384机器人液体处理器（或同等产品）（停产）（QIAGEN）
微孔板热封机（例如ALPS 50V微板热封机）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-1443）
气体可渗透粘合剂微板密封件（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0718）
条形码打印机（例如 Brady ^® LABXPERT™打印机）（Sigma-Aldrich，目录号：Z664588）
Brady ^® LABXPERT™打印机标签（Thermo Fisher Scientific，目录号：12879858）
荧光板读数器（例如 POLARstar OPTIMA，BMG LABTECH）
读板器堆垛机（BMG LABTECH）

软件

Microsoft Excel

程序

在-80℃下从存储中取出冻干的siRNA文库（76×96-孔板），并平衡至室温。
通过在1,000rpm下离心10分钟来沉淀孔内容物，并用干净的塑料盖替换板密封件
用3×25ml 70％乙醇清洁Multidrop 384分液盒，并用3×50 ml无菌DNase和无RNase的水冲洗。
通过在无菌DNase和无RNase的水中稀释5x siRNA缓冲液制备足够体积的1x siRNA缓冲液。
通过将165μl1×siRNA缓冲液分配到siRNA文库平板（96孔板）的3-12列，将0.5nmol siRNA文库重悬于3μM（参见注释1;图1A）。
使用标签制造商，为384孔主板打印文本或条形码标签（参见注释2）。
将标签贴在384孔培养板上（对于76 x 96孔培养板，您需要19 x 384孔培养板和标签）。这些将是384孔主板。
如上所述清洁Multidrop 384的分液盒，并在384孔Master板的第1和2列中分配110μl1x siRNA缓冲液（见注3;图1B）。
在1x siRNA缓冲液中稀释测定特异性siRNA对照至300nM（参见注释4）
在每个384孔Master板中将110μl的每个siRNA对照以水平重复的方式手动转移到3和4号孔中，即将RSCF siRNA转移到孔A3和A4中;将非靶向siRNA转移到孔B3和B4等。（图1C）
使用Multidrop 384将100μl1x siRNA缓冲液分配到每个384孔主板中的柱5-24
使用机器人液体处理器（例如QIAGEN RapidPlate 384），每个siRNA 96孔文库板具有单独的Zymark机器人吸头盒，将11μl来自siRNA文库平板（3μMsiRNA）转移至384孔Master盘子。每个384孔板需要4 x 96孔siRNA文库板（图1D）。这些板可以储存在-80℃直到需要
使用微孔板热封机和铝热封来密封siRNA库板，然后转移至-80°C长期保存。
为包含相关信息（重复数，测定类型等）的384孔测定板打印适当的条形码或文本标签（见注5）。
将标签贴到黑色，组织培养处理的，平的，透明底的384孔板上
如果冷冻，解冻384孔主板，并简单离心1分钟，在1,000 rpm，然后使用机器人液体处理程序和一个单独的盒的Zymark机器人吸头转移10微升到三个复制测定板384孔板的每个象限。
盖上准备的测定板与粘性板密封，放置在可密封的袋和使用前储存在-80℃长达2周（见注6）。
计算融合T175烧瓶中低通道Hela细胞的数量，以及您的测定所需的细胞总数。基于这些数量确定提供用于测定的细胞总数所需的50％融合T175烧瓶的数量。
在测定前几天，制备Hela细胞，使得在siRNA转染前一天有足够的100％汇合的T175培养瓶。
转染前一天，从汇合的T715细胞的Hela细胞中取出培养基，并用温热的无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞。
弃去洗涤，并通过在37℃下在5ml预热的胰蛋白酶中孵育约5分钟来移出细胞。
通过加入10ml生长培养基来灭活胰蛋白酶，并将预定体积的细胞转移到足够的T175烧瓶中，使得它们在第二天达到50％汇合（参见注释7）。
第二天，解冻重复测定板并在1,000rpm离心5分钟。用盖子拆下板密封件和盖子。
在适当体积的HBSS中将Dharmafect 1（DF1）转染试剂稀释至0.6％，并使用Multidrop 384的分配盒将10μl加入384孔测定板的每个孔中。
将测定板在1,000rpm离心1分钟，并在室温下孵育20分钟，以形成转染复合物。
从Hela细胞中移除生长培养基，在PBS中冲洗，并通过在37℃下在5ml胰蛋白酶中孵育〜5分钟来移出细胞。
加入10ml转染培养基使胰蛋白酶失活。
将每个烧瓶充分混合，将所有细胞混合在一起，并混合均匀，取出5×12μl等分的细胞悬液，在一次性血细胞计数器中计数。
计算平均细胞密度并稀释至7.5×10 4细胞/ml
在20分钟孵育时间后，将40微升细胞转移到测定板中的每个孔中，并在37℃下在湿润的培养箱中培养板48小时，以确保在调查测定输出之前基因消耗。
48小时后，确定基因耗尽对细胞活力的影响
解冻CellTitre蓝色试剂（或同等物），并使用Multidrop 384每孔加入5μl每个细胞活力复制板。
将板放回37℃培养箱中2小时，然后使用POLARstar OPTIMA板读数器（或等效物）测量每个板的荧光信号（485nm）。通过比较荧光与模拟转染细胞的平均荧光（第1列和第2列）（参见注释8）来确定siRNA耗尽对细胞活力的影响。
为了用HSV-1-eGFP感染重复测定平板，在37℃水浴中解冻HSV-1-eGFP病毒储液，直到刚解冻，然后在不含酚红的DMEM中稀释至0.5的感染复数（MOI）：F12/15mM HEPES/L-谷氨酰胺/5％FCS/pen-strep（见注9）。
通过翻转并摇动合适的液体废物容器，从所有板中取出介质。
使用低体积（2-10μl）8通道多通道移液器（见注10）手动添加10μl无酚红生长培养基到每个板的第1列和第2列。
使用Multidrop 384在剩余的孔（3-24列）中加入10μl稀释的病毒，并在1,000 rpm离心2分钟以除去气泡，确保细胞单层被小体积的接种物覆盖。
转移感染测试平板到37°C孵育器1小时，以允许病毒吸附，然后使用Multidrop 384添加50μl无酚红生长培养基到每个井。
用气体可渗透的粘性密封盖住板，堆叠并用塑料盖覆盖顶板，然后将所有测定板返回培养箱20小时。
将测定板放在荧光板读数器的堆叠器设备中，并监测病毒复制，作为每3-4小时荧光读板器中GFP荧光的测量，直到复制平台（参见注释11）。
一旦病毒复制周期完成，计算每个孔的生长的线性期的复制斜率，并通过将复制斜率与对照孔的平均复制斜率比较来确定基因缺失对病毒复制的影响（模拟，RSCF和非 - 靶向siRNA转染）。 Microsfot Excel中的 LINEST 方程式可用于计算复制斜率。该公式利用"已知的x"值（感染后的小时）和"已知的y"值（感染后的每个时间的相对荧光）。首先，生成一个具有"感染后小时"和样品的相对荧光的表格（图1A）。绘制这些数据并确定复制的线性相（图1B;红线表示线性相）。使用 linest 公式计算复制斜率，并将每个条件的斜率归一化为对照9的斜率，在此示例中，归一化为'Mock'转染的细胞;图1C-D）。

图1. 96和384孔板制备

图2.复制斜率计算

笔记

当产生384-孔主板时，文库板以1:10-300nM稀释，并在测定期间进一步稀释1:6。这得到50nM的最终siRNA浓度。如果优选较高/较低的siRNA浓度，则相应地调整重悬浮体积。 96孔siRNA文库板的第1和2列是空的，以使用户能够包括测定特异性对照
由于siRNA是温度敏感的，我们建议生成384孔主板，其含有足够的siRNA以一式三份完成三个全屏。 siRNA可以同时分配到重复测定平板中以确保测定平板的相同数目的冻融循环和可重现的测定结果。
将siRNA缓冲液单独添加到每个384孔主板的柱1和2中将导致未转染的对照细胞。对于我们的病毒复制测定，这些将保持未感染
确保包括模拟转染的细胞（单独的转染试剂），siRNA对照（例如无RISC和乱序，非靶向siRNA）和测定特异性siRNA，其显示已知范围的表型（强阳性效应，中度效应，强负面影响）。
对于病毒复制测定，我们建议进行每个测定一式三份。一个重复应该用于细胞生存力测定（如果siRNA基因缺失具有细胞毒性效应，则病毒不会复制），并且病毒复制测定重复进行。
虽然稀释的siRNA在-80℃下将稳定一段时间，但是这样小体积的蒸发的风险高。我们建议在使用前保存测定板不超过2周。
siRNA转染和病毒复制是最佳的，当细胞汇合（〜50％）和使用前新传代。
细胞滴定蓝试剂被代谢以产生荧光信号。因此，细胞活力通过细胞的代谢速率来证明。通过将siRNA转染的孔的荧光与对照，非转染孔（柱1和2）的平均荧光在每板的基础上进行比较以避免板间变化，来确定基因损耗对细胞活力的影响。以这种方式标准化荧光使得能够鉴定细胞毒性siRNA以及那些增加细胞增殖。根据制造商的说明书，<70％的对照细胞的荧光值被认为是细胞毒性的。细胞毒性siRNA从随后的数据分析中排除
用已知量的病毒（感染复数; MOI）感染细胞以产生合适的生长曲线是重要的。我们发现0.5 [0.5个病毒噬斑形成单位（PFU）/细胞]的感染复数（MOI）在感染后20至80小时得到理想的动力学生长曲线。 MOI取决于用于感染的细胞数量和体积，因此应基于病毒原液的起始滴度来计算适当的稀释因子。例如，为了以10μl的MOI 0.5感染3×10 3个细胞，我们需要具有含有1.5×10 5 PFU/ml的病毒制备物。因此，起始原料为6×10 ⁷ PFU/ml时，应稀释为400.
组织培养塑料制品，细胞和生长培养基都具有一定程度的荧光。当使用荧光报告基因时，因此必须具有适当的对照以提供背景荧光读数。对于该测定，将来自未感染细胞的荧光用作背景
在规则的时间间隔上监测复制以使得能够绘制完整的生长曲线（随时间的荧光）。当比较未处理和处理的样品之间的HSV复制时，我们使用在线性生长期的复制的斜率。因此，重要的是在该相位上尽可能多地进行测量（对于斜率计算的统计可靠性，具有最小值6）。使用您自己的设备进行的测试复制测定将允许建立线性生长的时间，并且可以调整测定时间以确保在这段时间内进行测量。

食谱

生长培养基
DMEM
5％FCS
1％pen-strep
转染培养基
酚红无DMEM：F12
15 mM HEPES
L-谷氨酰胺 5％FCS

致谢

该方案是从Griffiths等人（2013）PLOS Pathogens中描述的。作者感谢Peter Ghazal教授提供siRNA文库，Marie Craigon为图书馆处理，管理和建立方案提供技术援助。作者感谢MRC（G0501453 J.H.），BBSRC（BB/B019621/1 P.G.），Scottish Enterprise（P.G.）和Wellcome Trust（WT066784 P.G.）的资助。

参考文献

Arthur，J.L.，Scarpini，C.G.，Connor，V.，Lachmann，R.H.，Tolkovsky，A.M.and Efstathiou，S。（2001）。单纯疱疹病毒1型启动子活性，在初级背根神经元的潜伏期建立，维持和再活化期间< em> in vitro 。 J Virol 75（8）：3885-3895。
Griffiths，SJ，Koegl，M.，Boutell，C.，Zenner，HL，Crump，CM，Pica，F.，Gonzalez，O.，Friedel，CC，Barry，G.，Martin，K.，Craigon， Chen，R.，Kaza，LN，Fossum，E.，Fazakerley，JK，Efstathiou，S.，Volpi，A.，Zimmer，R.，Ghazal，P.and Haas，J.（2013）。对宿主因子的系统分析揭示了针对单纯疱疹病毒1型的Med23-干扰素λ调节轴复制。 PLoS Pathog 9（8）：e1003514。
Griffiths，S.J。（2013）。使用高通量RNAi在'病毒 - 宿主相互作用'中筛选具有前和抗病毒活性的宿主蛋白。 In： Methods in Molecular Biology。 1064：71-90。