材料和试剂

植物材料
1. 4至5周龄健康的N。本生植物
载体和细菌菌株
1. pDONR221或其它网关DONR载体（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：12536-017）
2. 大肠杆菌（大肠杆菌）DH10B或类似细胞用于分子克隆
3. SGR报道目的载体，SPDK 2388
  注意：该载体含有没有启动子的报告基因SGR。
4. TFs过表达的二元载体（例如来自拟南芥生物资源中心的 LIC6）
5. 用于表达阴性对照蛋白的双元载体[例如LIC6中的肌动蛋白7（At5g09810）]
6. 根瘤土壤杆菌（根瘤土壤杆菌）菌株GV2260
其他材料
1. BP和LR克隆酶Kit（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11789-013和11791-043）
2. LB媒体
3. Acetosyringone（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
4. 渗透介质（参见配方）

设备

培养箱（42℃）
1ml无针结核菌素注射器（Tyco，目录号：8881501400）
受控环境植物生长室（每天12小时，21℃）

程序

将感兴趣的转录因子克隆到SGR 报告载体中
1. 通过高保真PCR扩增来自植物基因组DNA的启动子片段（1-2kb），并根据制造商的说明使用BP反应将它们克隆到Gateway进入载体（pDONR221或pDONR207）中。这将产生含有启动子片段的入门载体
2. 通过LR反应将启动子片段转移到目的载体SPDK2388中。 LR反应应设置如下：
  100 ng  含有启动子的入门载体
  100 ng  目标向量SPDK2388
  2μl   LR酶缓冲液
  2μl   LR酶
  ddH 2 O至10μl
  在25℃孵育过夜。加入1μl蛋白酶K，37°C孵育10分钟。将反应混合物转化为E的化学感受态细胞。大肠杆菌DH10B或类似细胞，并在含有LB平板的50μg/ml壮观霉素（壮观霉素⁵⁰）上选择转化体。
制备植物和土壤杆菌菌株
1. 成长N。本生烟草具有12小时日光，22℃在生长室中。在4至5周时，植物应该有三到四个大的健康叶适合渗透
2. 分别将目标向量SPDK2388与感兴趣的TF和控件转换为 A。 tumefaciens GV2260通过使用化学或电感受态细胞。通常，200-500ng质粒和50μl感受态细胞用于转化。平板所有转化的细胞并选择在壮观霉素100，链霉素100，Rifampicin 25和Carbenicillin 50上的转化子。（SSRC）。应该预计有100多个转化体
评估启动子:: SGR报道构建体在N中的背景表达。本生植物叶
1. 使含有启动子:: SGR构建体的土壤杆菌属GV2260菌株在〜20mL具有SSRC的LB培养基中生长过夜。
2. 在3,000×g下将土壤杆菌培养物旋转10分钟，弃去上清液，并悬浮于浸润培养基中。将培养物的浓度调节至一系列OD 600。例如，0.05,0.1,0.3和0.6OD。在室温下孵育培养物3小时
3. 渗透 N。本生烟草叶用不同浓度的上述步骤C2中制备的土壤杆菌培养物培养。在叶的背面侧做一个小切口，使用1ml无针头的注射器将土壤杆菌培养物浸润到叶子中。培养物应覆盖直径约1cm的斑点（参见图1）。每个OD浓度渗透1-2个点，并将具有不同OD的所有样品渗透到单叶上。重复渗透到同一植物中的第二片叶子上。
4. 在同一生长室中保持浸润的植物48或72小时，并检查斑点的黄化迹象。选择最高的OD浓度，显示没有或轻微泛黄的以下实验。
  
  图1.本塞姆氏烟草中基于SGR报告基因的转录因子和启动子相互作用测定 .SUR1启动子:: SGR报道构建体与不同的MYB TFs共浸润（点1至7）或用阴性对照肌动蛋白（斑点0）。只有两个MYB（斑点1和2）显示严重的黄化迹象，表明这两个MYB激活SUR1启动子。
测定TF-启动子相互作用
1. 在具有SSRC的LB液体培养基中分别生长含有启动子:: SGR构建体，TF构建体和肌动蛋白对照的土壤杆菌属GV2260菌株过夜。
  注意：我们已经在LIC6二元载体中构建了ATEC文库，用于过表达15,000个拟南芥基因，其包括超过700个转录因子。所有这些克隆被保藏并可从ABRC订购。在ABRC中，ATEC克隆名称为"DKL"加上AGI编号。有关详细信息，请参阅参考文献3。
2. 旋转文化min和重新悬浮在浸润介质中。将报告培养物的OD调节至步骤C4中测定的浓度。将TF和肌动蛋白控制的OD调整为1.0
3. 将农杆菌培养物与报告物和TF或对照物等体积（每个约1ml）混合。在室温下孵育3小时
4. 渗透 N。本氏烟叶用来自上面的混合培养物到〜1cm的1-2个斑点到同一叶上。对照和处理样品应存在于同一叶上以克服叶对叶的变异性。
5. 在生长室中保持浸润的植物48至96小时。在浸润后24,48,72和96小时记录每个斑点黄化的迹象。黄化的严重性表示通过相应的TF的报告基因表达的强度。含有TF的斑点应当与对照斑点进行比较以评估TF-启动子相互作用的特异性。参见图1所示的示例。拍摄叶子以记录结果。
6. 观察结果的进一步验证可以使用基于荧光素酶的报告基因测定法进行，如Ma等人所述。（2013年）。

食谱

渗透介质
注意：每次准备新鲜培养基; 不需要灭菌。
10mM MgCl 2/
10 mM MES
200μM乙酰丁香酮

致谢

该协议改编自以下论文：Ma et al。（2013）。这项工作是由国家科学基金会拨款DBI-0723722和DBI-1042344和加州大学戴维斯基金SPDK支持。

参考文献

Hortensteiner，S。（2009）。 Stay-green调节叶绿素和叶绿素结合蛋白在衰老过程中的降解。 Trends Plant Sci 14（3）：155-162。
Ma，S.，Shah，S.，Bohnert，H. J.，Snyder，M。和Dinesh-Kumar，S.P。将基序分析并入基因共表达表达网络揭示了新的模块表达模式和新的信号通路。
9（10）：e1003840。
Popescu，S.C.，Popescu，G.V.，Bachan，S.，Zhang，Z.，Seay，M.，Gerstein，M.，Snyder，M.and Dinesh-Kumar，S.P。钙调蛋白相关蛋白与其靶标的差异结合通过高密度拟南芥 em>蛋白质微阵列。 Proc Natl Acad Sci USA 104（11）：4730-4735。