材料和试剂

拟南芥生态型哥伦比亚（ Col-0 ）和转基因拟南芥系35S :: S1CDF1 和<35> :: SlCDF3 （背景 Col-0 ）种子
70％乙醇
次氯酸钠（NaClO）
十二烷基硫酸钠（SDS）
无菌水
Murashige& 包括B5维生素的Skoog（MS）介质（Duchefa Biochemie BV，目录号：M0231）
MES（Duchefa Biochemie BV，目录号：M1503）
蔗糖
NaCl
琼脂（Duchefa Biochemie BV，目录号：P1001）
中等组成（见配方）

设备

方形（120×120mm）培养皿聚苯乙烯无菌
生长室
高压灭菌器
振动器
图像捕获设备
精密平衡（±0.0001）

软件

Image J软件（ http://rsb.info.nih.gov/ij ）（Abrámoff< et al。，2004）

程序

种子萌发
1. 种子通过在70％乙醇中洗涤2分钟，然后在灭菌溶液（1％次氯酸钠与1％SDS的无菌水溶液）中振荡12分钟进行表面灭菌，最后用无菌水洗涤5次。
2. 将种子在4℃下在黑暗中分层2天。
生长条件
1. 将灭菌的种子置于培养皿中（约70个种子/培养皿）在MS培养基上并在22℃的标准长日条件（16/8小时光照/黑暗）下在培养室中在垂直位置生长6天光周期）。
2. 生长6天后，将显示相似根长度（7-10mm）的幼苗转移到含有MS培养基（对照）或补充有80mM NaCl的MS培养基的方板上。约20棵幼苗每次重复使用，每次处理重复三次
3. 根尖的初始位置在板中标记（图1A）。
  
  图1.使用Image J软件进行原始和侧根测量的示例。A）根尖标记; B）处理10天后在补充有80mM NaCl的MS培养基上生长的幼苗的图像; C）比例设置（例如 30mm）; D-E）标记点的主根长度测量;和F）侧根的长度测量。
4. 植物在垂直位置下生长，长日照条件（22℃，16/8h光/暗）10天，然后拍摄每个平板的照片（图1B）。然后计算原始和侧根长度和植物重量
测量根长
通过使用Image J软件分析图像来进行原始和侧根长度的测量。
1. 首先，使用ImageJ软件设置刻度：>绘制已知距离的直线>点击分析>设置比例>已知距离（例如30mm）>长度单位（mm）>全局> ok（图1C）。
2. 使用软件的分段线选项从标记的起始位置到尖端测量主根的长度：按Control + M测量根的长度（图1D-E）。
3. 按照相同的程序测量每个侧根的长度（图1F）。
4. 为了评价对照和盐胁迫之间的生长差异，将原始和侧根的测量长度表示为相对于对照条件（MS培养基）的根生长减少的百分比（代表性数据参见图2）。
5. 通过单向方差分析（ANOVA），然后进行Student-Newman-Keuls试验（P <0.01）（图2）进行统计学分析。
植物鲜重的测量
鲜重测量使用精密天平估计。
1. 使用精密天平称量在MS培养基或补充有80mM NaCl的MS培养基中生长的全部10日龄植物（图3A-C）。
2. 通过单因素方差分析（ANOVA），随后的Student-Newman-Keuls试验（P <0.01）进行统计分析。在研究的基因型之间比较相对于对照条件的盐度生长减少的百分比
  
  图2.植物鲜重测量视图 A）小心地从培养基中取出小植株，B-C）用精密天平称重。

代表数据

使用ImageJ软件进行10天处理后，在盐度胁迫下的初级和侧根伸长测量结果的实例。测量如上所述进行（项目C：4和5）

图3.盐胁迫对拟南芥的根生长的测量效应的实例，所述根生长在过表达S1CDF1和scCDF3基因的细胞系中（Corrales ，2014）。 A）通过测定35S :: S1CDF1 品系1.2,1.4和2.6的初生根和侧根生长的减少来评估盐胁迫耐受性，在补充有80mM NaCl的MS中10天后，在野生型植物中，野生型Col-0植物，野生型 Col-0 35S :: SlCDF3系2.10,10.4和10.7。表示相对于对照条件的降低百分比。数据表示为三次独立实验的平均值±标准误差，每次至少有20株植物。星号表示Col-0和35S :: S1CDF1或35S :: S1CDF3过表达株系之间的显着差异（P <0.05; ANOVA Student-Newman-Keuls检验B）治疗后WT， 35S :: S1CDF1 系列2.6和 35S :: S1CDF3 系列2.10的图像。

食谱

中等组成
1. 对于1 L的MS对照培养基
  2.2g Murashige& 包括B5维生素的Skoog（MS）培养基 5克蔗糖 5克MES
  用KOH调节pH至5.7 加入7克琼脂
  使用高压灭菌器在121℃/1atm下灭菌20分钟
2. 对于1L培养基MS补充80mM用NaCl
  将4.67g NaCl加入到培养基中

致谢

我们衷心感谢通过国家农业技术研究所（INIA;项目编号：2009-0004-C01,2012-0008-C01）和西班牙科学和创新部（项目编号：BIO2010-14871和ERA-NET GEN2006-27772-C2-2）。此外，我们感谢Lakhssassi等人（2012年）描述的协议。

参考文献

Abràmoff，M.D.，Magalhães，P.J.and Ram，S.J。（2004）。使用ImageJ进行图像处理生物光子学 11（7）：36-43。
Corrales，AR，Nebauer，SG，Carrillo，L.，Fernandez-Nohales，P.，Marques，J.，Renau-Morata，B.，Granell，A.，Pollmann，S.，Vicente-Carbajosa，J.，Molina ，RV和Medina，J。（2014）。番茄循环因子的表征揭示了控制开花时间和非生物胁迫反应的保守和新功能。 65（4）：995-1012。
Lakhssassi，N.，Doblas，V. G.，Rosado，A.，del Valle，A.E.，Posé，D.，Jimenez，A.J.，Castillo，A.G.，Valpuesta，V.，Borsani，O.and Botella，拟南芥三七肽硫氧还蛋白样基因家族是渗透性胁迫耐受性和雄性孢子形成。植物生理学158（3）：1252-1266。