材料和试剂

C57BL/6小鼠（来自Harlan Laboratories（荷兰））注意：在该方案中使用的所有小鼠在6-12周龄之间，并且对于每个个体实验是性别和年龄匹配的。每个实验中每组使用三只小鼠。
OVA257-264和OVA323-339肽
注意：肽由洛桑大学的蛋白质和肽化学设备（PPCF）制造。
Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM），GlutaMAX TM补充剂（Life Technologies，Gibco ，目录号：31980-030）
青霉素 - 链霉素（5,000U/ml）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15070063）
2-巯基乙醇（2-ME，55mM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：21985-023）
牛血清（FBS）（具有低内毒素的性能血清：合格，来源于美国）（Life Technologies，目录号：26140或类似物）
磷酸盐缓冲盐水（Laboratorium Dr.Bichsel AG）
聚（I：C）HMW（tlrl-pic）和咪喹莫特R837（tlrl-imq，InvivoGen）
CpG-ODN 1826（Coley Pharmaceuticals，不再可用，CpG-ODN 1826，来自InvivoGen的tlrl-1826可以被取代）
来自Quillaja saponaria（Brenntag Nordic A/S）的Quil A皂苷混合物
用于Luminex平台（Life Technologies，Novex ，目录号：LMC0001）的细胞因子鼠标10-Plex面板，用于Luminex 100/200 TM和FLEXMAP 3D < sup>®系统
用户手册可在线查看： http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/手册/LMC0001_Protocol_Rev1.pdf
完成iscove的修改的杜尔贝科介质（cIMDM）（参见配方）

设备

1ml BD Tuberculin Syringe& 26g或27g×0.5"BD TM PrecisionGlide针（Beckton Dickinson，目录号：3052111或305109）
Falcon TM 24孔，未处理的平底组织培养板（Corning，目录号：351147）
〜40μm尼龙纱布片材切割成小正方形，例如Nylon Mesh Lab Pak，41微米正方形开口（Nitex，目录号：7050-1220-000-14）或尼龙6网片，48微米网格尺寸（小零件，目录号：B0043D1SCE）
来自1ml BD TM结核菌素注射器（BD，目录号：309602）的柱塞
解剖剪刀和细镊子或镊子
Falcon TM 96孔，未处理的U形组织培养板（Corning，目录号：351177）
具有xPONENT ^®软件（Life Technologies，Novex ^®）的Luminex ^® 200™系统

软件

xPONENT ^®软件（Life Technologies，Novex ^®）
使用GraphPad Prism软件
进行统计学测试注意：使用单因素方差分析与Dunnett多重比较检验比较所有组与单独肽组的不同组。

程序

实验方案
1. 在尾巴的基部，用100μlPBS中的10μgOVA 257-264和10μgOVA 323-339肽对C57BL/6小鼠皮下免疫。简而言之，将小鼠被限制在具有端部开口的保持隧道中以接近尾部的基部。将结核菌素注射器的针的大约一半长度插入到刚好在尾部上方和侧面的皮肤的皮下层中。正确的深度可以通过可视化皮肤下方的斜角来确认。在针入口点保持压力的同时缓慢注射疫苗。液体泡应该在皮肤下可见。应小心取出针头，并用指尖轻轻按摩出口点，以防疫苗逃逸。
2. 肽单独注射或与50μg下列佐剂之一组合注射：CpG-ODN（CpG），HMW Poly（I：C），咪喹莫特或Quil.
3. 在12或24小时后，通过CO 2窒息，随后颈脱位将小鼠安乐死，切除dLN（均为腹股沟淋巴结）。
4. 将LN迅速转移到含有250μl预热的cIMDM + 5％FBS的24孔板中，在小方形的45μm尼龙纱布上。将第二块纱布放置在LN组织的顶部，然后通过用1ml注射器柱塞的橡胶端轻轻压碎，同时用镊子将网格保持在适当的位置而解离。
5. 然后将细胞悬浮液立即移液到96孔u底板中，在37℃孵育1,6或12小时。
6. 将平板在300×g离心1分钟，然后除去65μl上清液，并在-20度冷冻以备后续分析。
  注意：从多个时间点收集的用于组合分析的样品应该总是快速冷冻以保存细胞因子。但是，如果只分析一个时间点，则可立即进行分析。
Luminex分析
1. 细胞因子产生用小鼠10-fold Luminex组[粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），IFN-γ，IL-1b，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL- -10，IL-12p40/p70和TNF-α]，并使用具有xPONENT软件的Luminex 200系统进行分析。
2. 在分析当天，将样品在室温下解冻
3. 在Luminex手册中概述的协议是精确遵循的。
4. 用由50％测定稀释剂和50％cIMDM组成的混合物重建标准品
5. 在分析物捕获阶段期间，将50μl解冻样品与50μl测定稀释剂一起加入luminex平板中。
6. 根据制造商的说明书，在具有xPONENT软件的Luminex？系统上运行样品。

食谱

完整媒体（cIMDM）
IMDM
100U/ml青霉素& 100μg/ml链霉素 55μM2-ME
5％FBS

致谢

以前发布的简称协议：Perret等人。（2013）。这项工作得到了新西兰研究科学与技术基金会和Emma Muschamp基金会（R. Perret）和瑞士国家科学基金会（310030-130812和CRSII3_141879）和Medic基金会（P. Romero）的资助。披露潜在的利益冲突：P. Romero是Immatics Biotechnologies，DC Prime，Matwin和巴斯德研究所（巴黎，法国）人类免疫中心的顾问/顾问委员会成员。其他作者未公开任何潜在的利益冲突。

参考文献

Perret，R.，Sierro，S. R.，Botelho，N. K.，Corgnac，S.，Donda，A.和Romero，P.（2013）。提高抗原特异性效应物与调节性T细胞比率的佐剂增强肿瘤免疫力。/a> Cancer Res 73（22）：6597-6608。