材料和试剂

设备

程序

刺激细胞
1. 为了刺激从T细胞释放IFN-γ，向细胞培养物中加入PMA（5ng/ml）和离子霉素（500ng/ml），并在37℃下孵育6小时。
2. 每6毫升细胞培养物加入4微升BD GolgiStop ^TM，并彻底混合（建议BD GolgiStop不能在细胞培养中保存超过12小时）。
收获细胞
1. 收集细胞并以1,500 rpm离心3分钟。
2. 用PBS洗两次。
3. 在含有2％FBS的PBS中稀释单细胞悬浮液至1×10 7个细胞/ml。
4. 在96孔板中每孔加入100μl细胞（1×10 6个/孔）
5. 在4℃下以800×g离心3分钟旋转板
6. 用冷PBS洗涤3次，如步骤7一样旋转
染色细胞表面抗原
1. 重悬细胞在100微升的Fc块（推荐稀释：1：1,000在PBS/2％FBS）。在冰上孵育10分钟。旋转。
2. 重悬于100μl表面抗体混合物（推荐稀释度：1：100在PBS/2％FBS中）。在室温下孵育20分钟，在黑暗中。旋转。
3. 用冷PBS洗一次。
染色细胞内抗原
1. 重悬在200μl的BD Cytofix/CytoPerm溶液中。在室温下孵育30分钟，在黑暗中。 Spin 1500 x g ，3分钟，4℃
2. 用200μlBD Perm /洗涤缓冲液洗涤两次。旋转，如步骤12.
3. 重悬在100微升细胞因子染色（推荐稀释：1：100在1倍电极/洗涤）。在冰上孵育，在黑暗中30分钟。旋转，如步骤12.
4. 用BD Perm/Wash洗涤两次，如步骤12中旋转。
5. 重悬细胞在300-400微升FACS缓冲液，并转移到Falcon圆底管在流式细胞仪上获取。

致谢

该方案以前用于Assenmacher等人。（1994）和Shang 等人（2004）。

参考文献

Assenmacher，M.，Schmitz，J。和Radbruch，A。（1994）。活化鼠T辅助淋巴细胞中细胞因子的流式细胞术测定：白细胞介素-10在干扰素-γ 和在白细胞介素-4表达细胞中。 Eur J Immunol 24（5）：1097-1101。
G，G，G，G，G，G，G，G，G，G G，G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G 。，Simpson，AJ，Old，LJand Chen，WF（2004）。自发的CD8 ⁺ T细胞对HLA-A2限制性 NY-ESO-1b肽在肝细胞癌患者中的作用。临床癌症研究（Clin Cancer Res）10（20）：6946-6955。