材料和试剂

感兴趣的细胞系和各种细胞培养基和从选择供应商传播的塑料制品
表达粘附素AfaE的[例如，血清型5a野生型菌株M90T，血清型5a非侵入性mxiD突变体（例如，血清型5a野生型菌株M90T，血清型5a非侵入性mxiD突变体对于阴性对照）或血清型5a ipgD - 突变体（在用该菌株感染时，半通道将保持开放延长时间）]
沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（例如野生型菌株SL1344）
致病性大肠杆菌（EPEC）（例如血清型O127：H6野生型菌株E2348/69）
Biocoat肠上皮分化环境（BD Biosciences，目录号取决于孔大小）
DMEM低葡萄糖（Life Technologies，Gibco ，目录号：A1515401）
100x MEM非必需氨基酸（Life Technologies，Gibco ，目录号：11140050）
100×10,000U/ml青霉素 - 链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140122）
胎牛血清（FBS）（热灭活）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10500056）
Hank's缓冲盐溶液（HBSS）（无酚红）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14025092）
Hank's缓冲盐溶液（HBSS）（无钙，无镁，无酚红）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14175095）
10x HBSS储备溶液而不是即可使用HBSS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14065056和14185052）。
1 M HEPES（Life Technologies，Gibco ，目录号：15630080）
1 M MgCl 2
0.5 M Na-EGTA
细菌生长培养基[例如Luria-Bertani肉汤（Life Technologies，目录号：10855001）; 根据制造商的说明书（Life Technologies，目录号：22700025）针对沙门氏菌和EPEC制备的Luria-Bertani琼脂粉末; 胰蛋白酶大豆肉汤（大豆酪蛋白消化培养基，BD，目录号：257107）; 根据制造商的说明书制备的胰蛋白酶大豆琼脂粉末（大豆 - 酪蛋白消化琼脂培养基，Difco，目录号：236950），用于志贺氏菌]
含有刚果红的细菌的生长培养基（参见配方）
用于繁殖TC7细胞的培养基（参见配方）
用于HelaCx26或HelaCx43细胞繁殖的培养基（参见配方）
HBSS解决方案（参见配方）
HBSS溶液缺乏Ca ^{2 +}（参见配方）

设备

细胞培养孵育器
所需尺寸的盖玻片（例如 24孔板）（如果需要）
水浴
移液器
愿望
清洁长椅
细菌培养孵化器
离心机适于旋转培养板（用于EPEC感染）

程序

将细胞保持在37℃和10％CO 2的匹配培养基中，在潮湿环境（培养箱）中，并根据标准方案传代。
在实验前一天将细胞接种在培养板或所需大小的盖玻片（例如24孔板）上，并在70-80％融合度下使用。对于感染，将细胞保持在没有抗生素的培养基中至少24小时
为了获得极化的TC7细胞，根据生产商提供的方案使用Biocoat肠上皮分化环境。

为了诱导半通道开放与低细胞外Ca <
1. 将细胞用温热（37℃）HBSS小心洗涤两次，并用不含Ca 2+的温热HBSS洗涤一次。对于极化的TC7细胞，顶端和基底外侧都必须用缓冲液洗涤（通过用镊子小心地提起含有细胞的transwell腔室并替换孔中的缓冲液）。对于阴性对照，仅使用HBSS
2. 加入不含Ca 2+的新鲜温热HBSS，并将细胞在37℃（例如在培养箱，加热的显微镜中或漂浮在水浴中）温育。对于极化的TC7细胞，顶端和基底外侧都暴露于缺乏Ca 2+的HBSS。对于阴性对照，使用HBSS
3. 半通道可以通过交换没有Ca ^{2 +}的HBSS与HBSS再次闭合。
使用志贺氏菌引起半通道开放
1. 在感染之前，将细胞在室温下用HBSS仔细洗涤两次。洗涤细胞并保持在室温（而不是使用温热缓冲液）以同步感染。事实上，III型的活性分泌系统（T3SS-志贺氏菌，沙门氏菌和EPEC中的主要毒力决定子）是温度依赖性的，例如在志贺氏菌中 T3SS不是活性低于35℃。因此，将样品转移到37℃以仅在细菌粘附到细胞表面之后触发感染细菌菌株作为甘油储备在-80℃保存。在含有0.01％（w/v）刚果红的大豆 - 酪蛋白消化琼脂上划线，并在37℃下生长过夜以选择毒性菌落（毒性菌落为红色，菌落丢失毒力质粒是白色的）。挑取单个菌落，在37℃和200rpm下在大豆 - 酪蛋白消化肉汤中生长过夜，如果指示，用抗生素培养，并将200倍稀释度培养至OD 600nm = 0.3-0.5。
2. 将细菌在室温下在HBSS中稀释，在室温下以1:5的多重感染（MOI）（靶细胞：细菌）加入到非极化细胞中，并允许附着15分钟。对于极化的TC7细胞，在顶端侧以1:40的MOI添加细菌
3. 去除HBSS以消除非粘附的细菌（在极化的细胞中，缓冲液必须在顶端和基底外侧交换以控制温度），加热（37℃）HBSS并将细胞在37℃（例如 15分钟），在孵化器中或漂浮在水浴中）。例如
用沙门氏菌诱导半通道开放
1. 在感染之前，将细胞用HBSS在室温下仔细洗涤两次细菌菌株作为甘油储备在-80℃保存。将沙门氏菌在Luria-Bertani（LB）琼脂上划线以分离菌落并在37℃下生长过夜。第二天晚上，挑选单个菌落，在37℃和200rpm的LB-肉汤中生长过夜，如果指示，用抗生素。
2. 将细菌在室温下在HBSS中稀释，并在RT（对于极化的TC7细胞在顶侧上）以1:2.5的多重感染（MOI）（靶细胞：细菌）加入。
3. 将细胞在37℃（例如在孵育器中漂浮或在水浴中漂浮）孵育所需时间（例如 2分钟 - 用沙门氏菌感染） em>很快进行细菌粘附素）。
使用EPEC 启动半通道开启
1. 在感染之前，将细胞用HBSS在室温下仔细洗涤两次细菌菌株作为甘油储备在-80℃保存。将EPEC在Luria-Bertani（LB） - 琼脂上划线以分离集落，并在37℃下生长过夜。第二天晚上，挑选单个菌落，在37℃和200rpm的LB-肉汤中生长过夜，如果指示，用抗生素。
2. 使细菌生长过夜，在室温下在HBSS中稀释并在RT（对于极化的TC7细胞在顶侧上）以1:2.5的多重感染（MOI）（靶细胞：细菌）加入。
3. 通过在合适的离心机中旋转培养板以促进它们的粘附，将细菌在室温下以180×g离心10分钟。
4. 去除HBSS以消除非粘附的细菌（在极化的细胞中，缓冲液必须在顶端和基底外侧交换以控制温度），加热（37℃）HBSS并将细胞在37℃（例如在孵化器中或漂浮在水浴中）持续所需时间（例如 2小时 - 用EPEC进行的感染进行得很慢。

代表数据

注意结果的重现性和变异性。
1. 如果通过降低细胞外Ca 2+浓度诱导半通道开放，则变异性比由感染诱导（20-30％）更低（10-20％）。最好制备一式四份的感染（理想情况下从单独的文化，以避免稀释依赖的文物）。
2. 如果半通道在暴露于缺乏Ca 2+ 2 +的培养基时不开放，则可能存在残留的Ca 2+ 2+（例如），因为洗涤步骤不仔细执行）。

笔记

许多细胞系已丧失Cxs的表达，因此不具有半通道。确保感兴趣的细胞系有。
在实验过程中，小心处理细胞，因为半通道是机械敏感的。过度摇晃和剧烈的介质交换将引起半通道打开，因此增加了后续测量的背景
对于HBSS，可以使用10x储备溶液
对于感染，HBSS可以用不含酚红的DMEM代替用于与细菌的洗涤和温育
如果希望定量在半通道开放时释放的分子，使用足够的（细胞应该被良好覆盖，例如在24孔板中200μl），但是在孵育期间不是高体积的缓冲液，否则所关注的分子将被不必要地稀释
，沙门氏菌和EPEC在粘附上皮细胞的能力和粘附和感染发生的速度方面不同。因此，添加细菌的步骤和孵育时间必须适应

食谱

含有刚果红的培养基
准备刚果红（100x）的1％（重量/体积）浓缩储备溶液，例如在50ml蒸馏水中的0.5g刚果红粉末。使用0.2μm孔径的过滤器过滤灭菌，并为您准备的体积提供足够的过滤能力。向液体大豆 - 酪蛋白消化琼脂中加入刚果红贮备液，例如，当高压灭菌溶解的粉末，当其已经冷却至约55℃时。加入刚果红至终浓度为0.01％（重量/体积），例如在500ml生长培养基中的5ml刚果红贮备液。
用于繁殖TC7细胞的培养基
将500ml无菌DMEM与5ml无菌青霉素+链霉素（100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素最终，任选），5ml无菌非必需氨基酸（来自100x储备溶液）和50ml无菌FBS混合。 br /> 储存在4°C
用于繁殖HelaCx26或HelaCx43细胞的培养基
将500ml无菌DMEM与无菌5ml青霉素+链霉素（100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素最终，任选）和无菌50ml FBS混合
储存在4°C
HBSS解决方案
将HBSS与1M HEPES混合至终浓度为20mM（例如，1ml 1M HEPES，最终体积为50ml）
HBSS溶液缺乏Ca ^{2 +}
将不含钙和镁的HBSS与1M HEPES混合至终浓度为20mM（例如，对于50ml终体积，例如1ml 1M HEPES），将MgCl 2至终浓度 1mM（例如来自1M储备液的50μl）和EGTA至终浓度0.1mM（例如来自0.5M储备液的10μl）。

致谢

A.P.是随后的EMBO长期和Marie Curie欧洲内部奖学金的接受者。该项目得到ANR拨款2010 MIDI 007 01至A.P.和P.J.S. 和ERC高级授予HOMEOEPITH 该协议的第一个简短版本发布在Puhar et al。（2013）。

参考文献

Evans，W.H.，De Vuyst，E.and Leybaert，L。（2006）。间隙连接细胞互联网：连接蛋白半通道进入信号传导。 Biochem J 397（1）：1-14。
Paemeleire，K.，Martin，P.E.，Coleman，S.L.，Fogarty，K.E.，Carrington，W.A.，Leybaert，L.，Tuft，R.A.，Evans，W.H.and Sanderson，M.J。（2000）。表达GFP-标记的连接蛋白43,32或26的HeLa细胞中的细胞间钙波。 Mol Biol Cell 11（5）：1815-1827。
Puhar，A。和Sansonetti，P.J。（2014）。通过Connexin Hemichannels进行染料吸收实验生物协议 4（17 ）：e1221。
Puhar，A.，Tronchère，H.，Payrastre，B.，Tran Van Nhieu，G.and Sansonetti，P.J。（2013）。 Shigella 效应通过调节上皮释放的危险信号ATP来抑制炎症生产脂质介体PtdIns5P。免疫 39（6）：1121-1131。
Tran Van Nhieu，G.，Clair，C.，Bruzzone，R.，Mesnil，M.，Sansonetti，P.and Combettes，L。（2003）。连接蛋白依赖性细胞间通讯增加了志贺氏菌的侵袭和传播。上皮细胞。 Nat Cell Biol 5（8）：720-726