材料和试剂

表达3x FLAG标记的GfsA（Komachi等人，2013），
3x FLAG-肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
从小鼠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）产生的抗FLAG M2-琼脂糖
小鼠IgG-琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A0919）
2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：GB10）
氢氧化钠（NaOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：198-13765）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
氯化钾（KCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：133-00725）
甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00611）
3 - [（3-胆酰氨基丙基）二甲基铵基] -2-羟基丙磺酸盐（CHAPSO）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：C020）
完全蛋白酶抑制剂混合物片剂（无EDTA）（Roche Diagnostics，目录号：1873580）
液氮
缓冲区A（参见配方）
最小介质（MM）（参见配方）
Hutner的微量元素（参见配方）

设备

撒布机
500 ml Sakaguchi烧瓶
砂浆和杵
吸气器
用角转子离心
用旋转式搅拌器离心
超速离心机
小铲
15-ml塑料离心管（例如Greiner Bio-One GmbH）
4℃孵育器
30℃培养箱
旋转器（例如，TAITEC）
滤纸（Munktell& Filtrak GmbH，目录号：113053）

程序

将来自冷冻储存物的构巢曲霉分生孢子分生孢子在最小培养基（MM）平板上培养，并在30℃下培养3天。
使用撒布机收集形成的分生孢子。
将分生孢子（1×10 5）铺在MM平板上，在30℃培养3天。
将收集的分生孢子（2×10 7个）接种到500ml坂口烧瓶中的100ml MM中。
将烧瓶以126rpm在30℃摇动24小时
通过纸过滤收集菌丝体细胞
用约30ml蒸馏水洗涤细胞两次。
注意：在这一步骤之后，尽可能使用勺子将湿细胞拧干，使细胞很容易被压碎。
使用研钵和研杵在液氮中将细胞（25g湿细胞）粉碎成细粉末。
将裂解的细胞重悬于100ml含有Complete TM蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA）的缓冲液A中。
通过用角转子以10,000×g离心10分钟除去细胞碎片。
使用超速离心机将上清液以100,000×g离心45分钟
使用刮刀将所得沉淀重悬于10ml含有0.5％CHAPSO的缓冲液A中。
注意：需要进行中试实验以确定洗涤剂溶解目标蛋白的合适条件。
使用旋转器轻轻混合样品1小时，得到溶解的膜蛋白
使用超速离心机将样品以100,000×g离心30分钟
收集上清液（约10毫升）到15毫升塑料离心管中
加入小鼠IgG琼脂糖（100微升）到上清液，轻轻摇动混合物1小时（视频1）。

视频1.使用旋转器振动混合物
通过用摆动转子以1,400×g离心10分钟除去小鼠IgG-琼脂糖。
向上清液中加入200μl抗FLAG M2亲和凝胶，轻轻摇动所得混合物1小时
通过用摆动转子在1,400×g下离心10分钟收集抗FLAG M2亲和凝胶。
用吸气器轻轻取出上清液。
用15ml含有0.1％CHAPSO的缓冲液A重悬所得的琼脂糖
重复步骤18-20五次。
用20μl含0.1％CHAPSO的缓冲液A（含0.5μg/μl3×FLAG肽）洗脱GfsA蛋白。

图1. GfsA-3xFLAG蛋白的纯化通过5％-20％SDS-PAGE分离总共0.5mg（银染色）蛋白，然后通过银染法进行测定。检测到GfsA-3xFLAG为67kDa蛋白。星号表示GfsA-3xFLAG的降解产物或不足的N - 糖基化产物。

笔记

在冰上或在4°C进行所有操作。

食谱

缓冲液A（1L）

化合物
金额

HEPES
11.9克

NaCl
5.84克

KCl
2.24克

MnCl 2 ^。 4H O
0.2 g

甘油
50克

加水，使最终溶液的体积为1 L 使用0.45μm过滤器过滤灭菌溶液
储存在4°C

最小培养基（1L）

化合物	金额
NaNO ₃	6.0克
KCl	0.52克
MgSO 4 ^。 7H <2> 0	0.52克
KH ₂ PO ₄	1.52克
葡萄糖	10.0克
Hutner的微量元素	2 ml

用NaOH
调节pH至6.8 加水，使最终溶液的体积为1 L 高压灭菌20分钟

Hutner的微量元素

化合物	金额
H 2 O（60℃）	100 ml
ZnSO 4 ^。 7H <2>	2.2 g
H ₃ BO ₃	1.1克
MnCl 2 ^。 4H 2 O	0.5克
FeSO 4 ^。 7H <2> O	0.5克
CoCl <2> ^。 6H ₂ O	0.16 g
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O	0.16 g
（NH 4）6 Mo 7+ O 24+。在本发明的一个实施方案中， O	0.11克
EDTA	5.0 g

用KOH
调节pH值至6.5-6.8

致谢

该协议改编自以前发表的论文Komachi等人，2013年。该工作部分由来自日本科学促进会的青年科学家的助学金（B）支持（JSPS）（21780313,23780350和26450106）（至T.O.）。

参考文献

Komachi，Y.，Hatakeyama，S.，Motomatsu，H.，Futagami，T.，Kizjakina，K.，Sobrado，P.，Ekino，K.，Takegawa，K.，Goto，M.，Nomura， Oka，T。（2013）。 GfsA 编码参与半乳糖呋喃糖抗原生物合成的新型半乳糖呋喃糖基转移酶 > 90 90（5）：1054-1073 。