材料和试剂

构巢曲霉分生孢子
柠檬酸三钠二水合物（C 6 H 5 H 5 Na 3 O 7） 2> O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01785）
柠檬酸（C 6 H 8 O 7）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：030-05525）
乙基-4-氨基苯甲酸酯（C 9 H 11 NO 2）（ABEE）（Tokyo Chemical Industry，目录号：A0271）
氰基硼氢化钠（NaBH 3 CN）（Tokyo Chemical Industry，目录号：S0396）
氯仿（Wako Pure Chemical Industries，目录号：038-02606）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：050-00446）
三氟乙酸（TFA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：206-10731）
冰乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：012-00245）
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：136-09475）
D-半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）
ABEE标签混合物（参见配方）
HPLC溶剂A（参见配方）
HPLC溶剂B（参见配方）
最小培养基（见配方）
Hutner的微量元素（参见配方）

设备

50-ml塑料离心管（例如Greiner Bio-One GmbH）
1.5毫升锥形螺帽管和帽
撒布机
500 ml Sakaguchi烧瓶
离心机
旋转器（例如，TAITEC）
配备有荧光检测器（Hitachi，LaChrom Elite，型号：L-2485）和用于HPLC峰分析的软件（例如，Hitachi，型号：D-2000 Elite）的高效液相色谱 HPLC）
离心蒸发器（例如，SpeedVac ^®）
热块或水浴
GlycoScope Honenpak C18柱（4.6mm×75mm）（COSMO BIO，目录号：JOM-J715-1PC）
滤纸（Munktell& Filtrak GmbH，目录号：113053）
透析膜（New York的BioDesign Inc.，目录号：D102）

程序

将来自冷冻原种的构巢曲霉分生孢子分生孢子在最小培养基（MM）平板上培养，并在30℃下培养3天。
使用撒布机收集形成的分生孢子。
将分生孢子（1×10 5）铺在MM平板上，在30℃培养3天。
将收集的分生孢子（2×10 7个）接种到500ml坂口烧瓶中的100ml MM中。
将烧瓶以126rpm在30℃摇动24小时
通过纸过滤收集菌丝体细胞
用约30ml蒸馏水洗涤细胞两次（视频1）。

视频1.收集和洗涤菌丝体细胞
将细胞（约2g湿细胞）重悬在10ml的100mM柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）中。
将样品在121℃高压灭菌120分钟
通过纸过滤除去细胞碎片（视频2）。

视频2.通过纸张过滤除去细胞碎片
在50ml塑料离心管中收集所得样品（约10ml）
加入30ml冷的99.5％乙醇，并将样品在冰上保持30分钟
在4℃下以14,000×g离心10分钟
在室温下使用离心蒸发器在1500×g下干燥沉淀。
将沉淀重悬在2ml蒸馏H 2 O（dH 2 O）中。
用透析膜（15.5mm×300mm）对5L dH 2 O在4℃透析样品24小时。将所得样品称为提取的半乳糖甘露糖蛋白
将部分（2.4μg）提取的半乳糖蛋白在500μl4M三氟乙酸（TFA）中在100℃下在1.5-ml锥形螺旋盖管中孵育4小时。
在室温下使用离心蒸发器在1500×g下干燥所得样品。
将样品重悬于10μldH 2 O中。
使用ABEE标记混合物用荧光的p-氨基苯甲酸乙酯（ABEE）标记水解产物。
1. 向样品中加入40μlABEE标记混合物（在70℃预热5分钟）
2. 在80℃下孵育样品1小时。
3. 将样品冷却至室温。
4. 向样品中加入200μldH 2 O和200μl氯仿
5. 剧烈涡旋样品，然后在室温下以14,000×g离心5分钟。
6. 收集上层水层。
使用HPLC系统分析ABEE标记的D-吡喃半乳糖。以45℃下1.0ml/min的流速将20μl样品注入柱中。 ABEE-D-吡喃半乳糖可以用荧光检测器在360nm的激发波长和305nm的发射波长下检测。
注意：使用含有乙腈和硼酸钾缓冲液的溶剂（参见溶剂A和B的配方部分）。以1.0ml/min（表示为溶剂A的百分比）的流速设置梯度程序并应用以下梯度以分析ABEE-D-吡喃半乳糖：0-45分钟，等度100％; 45-50分钟，100-0％; 50-55分钟，0-100％; 55-75分钟，等度100％。使用D-半乳糖作为定量标准。

食谱

ABEE标签混合物
165 mg ABEE
35mg氰基硼氢化钠 41μl冰乙酸
350μl甲醇
该混合物可以长期储存在-20℃下
HPLC溶剂A [含有6％乙腈的0.2M硼酸钾缓冲液（pH9.0）] 12.4g H sub 3 BO Sub 3
60 ml乙腈加入水，使最终溶液达到1L总体积，同时用氢氧化钾（KOH）调节pH9.0
HPLC溶剂B [含有50％乙腈的0.2M硼酸钾缓冲液（pH9.0）] 12.4g H sub 3 BO Sub 3
500ml乙腈加入水，使最终溶液达到1L总体积，同时用氢氧化钾（KOH）调节pH9.0
最小培养基（1L）
用NaOH
调节pH值至6.8 加水，使最终溶液的体积为1 L 高压灭菌20分钟
Hutner的微量元素

致谢

该协议改编自先前发表的论文Komachi等人（2013）和Yasuno等人（1997）。这项工作部分得到日本科学促进会（JSPS）（21780313,23780350和26450106）（到T.O.）的青年科学家助学金（B）的支持。

参考文献
1. Komachi，Y.，Hatakeyama，S.，Motomatsu，H.，Futagami，T.，Kizjakina，K.，Sobrado，P.，Ekino，K.，Takegawa，K.，Goto，M.，Nomura， Oka，T。（2013）。 GfsA编码参与构巢曲霉中O-聚糖的半乳糖呋喃糖抗原生物合成的新型半乳糖呋喃糖基转移酶和 Aspergillus fumigatus 。 Mol Microbiol 90（5）：1054-1073。