图1. CRISPR-Cas9系统示意图

材料和试剂

水稻 L.ssp japonica ，Kitaake，Nipponbare或其他栽培品种
根癌农杆菌菌株EHA105
pRGEB31（Xie和Yang，2013）（Addgene质粒51295，质粒图谱显示于图2）

图2. pRGE31和pRGEB31载体的示意图。在此协议中使用pRGEB31载体。
I（New England Biolabs，目录号：R0535S）
70％，100％乙醇
碱性磷酸酶，小牛肠（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0290S）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
T4多核苷酸激酶（T4 PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201S）
T7核酸内切酶I（T7EI）（New England Biolabs，目录号：M0302S）
GoTaq DNA聚合酶（Promega Corporation，目录号：M3001）
Phusion高保真聚合酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：F530S）
5x绿色GoTaq反应缓冲液（Promega Corporation，目录号：M7911）
QIAGEN质粒小试剂盒（QIAGEN，目录号：12123）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Sigma-Aldrich，目录号：H9151）
月桂酰肌氨酸钠（sarkosyl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP235-500）
CTAB缓冲区（请参阅配方）

设备

37°C水浴
热循环仪
DNA电泳仪
微量离心机

程序

设计gRNA以靶向感兴趣的基因
1. 选择靶向位点并设计如图1所示的gRNA间隔序列。对于8种模型植物物种，可以使用CRISPR-PLANT数据库容易地设计特异性gRNA间隔物（Xie等人，2014）（< a target ="_ blank"href ="http://www.genome.arizona.edu/crispr"> http://www.genome.arizona.edu/crispr ）。设计gRNA时可考虑以下因素。
  1. 为了功能性敲除感兴趣的基因，设计的gRNA应将DSB引入靠近编码区5'-末端或位于基因功能的基本结构域中。
  2. 选择的gRNA间隔区/靶序列应具有足够的特异性（我们建议gRNA间隔区在CRISPR-PLANT数据库中按0.0和1.0特异性排序）以避免脱离目标编辑
  3. （可选）检查gRNA折叠，优选具有三个茎环的gRNA，如图1所示
  4. （可选）如果可能，设计一个gRNA，其将在限制性核酸酶（RE）位点产生突变，以引入用于基因分型的RFLP（限制性片段长度多态性）。
2. 在选择靶位点和间隔序列之后，合成DNA寡核苷酸以构建如图3所述的gRNA。应当添加合适的接头序列用于克隆。反向引物应当包含5'-AAAC-3'的接头，而正向引物应该包括具有5'-GGCA-3'的接头（参见图3情况1，gRNA-间隔物以A开始）或5'-GGC -3'（图3情况2，gRNA-间隔物以G/C/T开始）注意：图3中设计为病例1和2的gRNA在我们的实验中显示出相当的效率。
  
  图3.设计DNA寡核苷酸以构建RGE质粒的简单指南（Xie et al。，2014）

构建gRNA-Cas9质粒

通过 I，摘要pRGEB31载体（见图3的载体细节）。

pRGEB31
2微克

10x NEB缓冲区4
2微升

10x BSA
2微升

Bsa I（NEB）
1微升

将H ₂ O添加到
20微升

在37℃孵育2-4小时
（可选）加入0.5μlCIP，通过在37℃孵育30分钟使载体去磷酸化。
使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的载体
在PCR管中制备DNA寡核苷酸，如下：

正向寡核苷酸（100uM）
1微升

反向寡核苷酸（100uM）
1微升

10×T4 DNA连接酶缓冲液
1微升

T4 PNK（NEB）
0.5μl

H sub 2 O
6.5μl

注意：如果在步骤5中不用CIP处理载体，则不需要T4 PNK。
使用以下程序在热循环仪中孵育试管。

37°C
60分钟

95°C
10分钟

以0.1℃/秒
冷却至25℃

制备1:20稀释的寡聚双链体用于连接

将稀释的寡聚双链体导入载体：

我已消化的矢量	n μl（〜50 ng）
低聚双链（稀释）	1微升
10×T4 DNA连接酶缓冲液	0.5μl
T4连接酶（NEB）	1微升
将H ₂ O添加到	5微升

在室温（25℃）孵育2-4小时或在4℃过夜
转换 E。大肠杆菌DH5α感受态细胞（自制），使用1μl连接产物
在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中接种2-4个菌落
使用QIAGEN Plasmid Mini试剂盒从转化的DH5α细胞中纯化质粒
使用M13R（-48）引物通过Sanger测序确认pRGEB31-gRNA质粒构建体。

水稻转化
1. 将pRGEB31-gRNA质粒导入农杆菌菌株EHA105中。
2. 使用标准土壤杆菌介导的转化方法转化水稻胚胎发生的愈伤组织

基因分型
注意：可以在潮霉素B选择的愈伤组织或转基因植物中检查Cas9-gRNA引入的突变。为了检查Cas9-gRNA导入的突变，需要一对基因特异性引物来扩增靶向区域。由于水稻中Cas9-gRNA系统的高效率，步骤22和23是任选的，并且可以通过PCR产物的直接Sanger测序容易地检查靶向位点的突变（步骤23）。

基因组DNA提取。
1. 在1.5ml管中研磨10-50mg转基因稻植物的叶/愈伤组织
2. 向管中加入200μl加热（60℃）CTAB缓冲液，立即混合并在60℃下伴随振荡孵育10分钟。
3. 加入80μl氯仿，涡旋并在端到端摇臂中在室温下孵育20分钟
4. 在室温下以14,000×g离心5分钟
5. 将上层水相转移至新鲜管中，加入1/10体积的乙酸钠（3M，pH5.3）和2.5体积的100％乙醇，并在冰上孵育10分钟。
6. 在室温下以14,000×g离心5分钟
7. 丢弃液体。
8. 加入0.5ml的70％乙醇，并以14,000×g离心5分钟
9. 弃去上清液，在空气中干燥沉淀
10. 将基因组DNA溶解在50-100μlH 2 O中。

使用从转基因水稻和野生型植物提取的基因组DNA进行PCR扩增的设置反应

水稻基因组DNA	100 ng
dNTP（10mM）	1微升
正向引物（10μM）	1微升
反向引物（10μM）	1微升
5x Green GoTaq ^®反应缓冲液	10微升
Taq聚合酶（2U /μl）	1微升
将无菌蒸馏的H 2 O加入到中	50微升

通过PCR扩增靶区域[退火温度（x）和延伸时间（n）取决于引物]

95°C
3分钟
1个周期

95°C
15秒
35个周期

x °C
20秒

72℃
分钟

72℃
2分钟
1个周期

4°C
暂停
1个周期

（可选）如果引入RFLP（示例如图4所示）
1. 向25μlPCR产物（〜200ng）中加入5U明胶酶限制酶
2. 在37℃孵育2-4小时
3. 通过1％琼脂糖凝胶电泳分析消化的DNA片段

（可选）如果没有引入RFLP，使用T7E1测定法检测突变：
注意：在T7E1测定的步骤19中应使用高保真DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶）。 T7E1测定不能检测纯合突变。示例（行＃1和＃3）如图4所示。

使用PCR纯化柱纯化PCR产物
在PCR管中设置T7E1测定如下：

PCR产物
100-200 ng

10x NEB缓冲区2
1微升

将H ₂ O添加到
9.5微升

使用以下程序使PCR产物变性和退火：

95°C
10分钟
9.5微升

使用以下程序使PCR产物变性和退火：

95°C	10分钟 ...	Ramp to 65 °C at 0.1 °C/sec
65 °C	2 min
Ramp to 45 °C at 0.1 °C/sec
45°C	2分钟
以0.1℃/秒的速度上升至25℃
25°C	保持

向退火的PCR产物中加入0.5μlT7E1。
将反应在37℃下孵育1小时
通过琼脂糖凝胶电泳分析消化

克隆和序列PCR产物（至少4个菌落）以确认转基因植物中的突变。
注意：T7E1酶不是绝对错配特异性的;它也缓慢地切割dsDNA。因此，重要的是控制酶量和反应时间，并仔细解释T7EI测定中的结果。

图4.使用T0转基因植物的PCR-RFLP测定（A）或T7E1测定（B）的实施例。在PCR-RFLP测定中，突变的DNA对RE消化有抗性，而野生型DNA将被切割成片。基于PCR-RFLP结果，在转基因株系＃1，＃3和＃4（T0代）中没有检测到野生型DNA，表明水稻中RGE的高效突变率。值得注意的是，PCR-T7E1测定中来自线＃1和＃3的额外条带的大小不同于线＃4中的预期大小，这可能是由T7E1酶的不完全特异性引起的。基于这些测定和最终测序结果，发现线＃1和＃3在靶位点含有纯合的相同突变，而线＃4在靶位点含有杂合的不同突变。

食谱

CTAB缓冲液（100ml）将2.56g山梨醇，1g Sarkosyl和0.8g CTAB溶解在60ml H 2 O中。
加入11ml Tris缓冲液（pH8.0,1M），4.4ml EDTA（pH8.0）和16ml NaCl（5M）
将溶液短暂加热以溶解CTAB和Sarkosyl
将dH <2> O添加到100 ml
高压灭菌并在室温下贮存

致谢

这项工作是由宾夕法尼亚州立大学和NSF植物基因组研究计划（DBI-0922747）到YY的研究资助。

参考文献

Xie，K.and Yang，Y。（2013）。使用CRISPR-Cas系统在植物中进行RNA指导的基因组编辑 Mol Plant 6（6）：1975-1983。
Xie，K.，Zhang，J.and Yang，Y.（2014）。在模型植物中CRISPR-Cas9介导的基因组编辑的高度特异性引导RNA间隔区的全基因组预测和主要作物。 Mol Plant 7（5）：923-926。