材料和试剂

甘露醇
3-吗啉代丙烷-1-磺酸（MOPS）
氢氧化钾（KOH）
牛血清白蛋白（BSA）
乙二胺四乙酸（EDTA）
半胱氨酸
Percoll
蔗糖
二甲基亚砜（DMSO）
液氮
提取介质（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
渐变缓冲区（参见配方）
Percoll渐变（参见配方）

设备

马铃薯块茎
6×250ml预冷角转子（例如，Beckman Coulter，型号：JA-14或Thermo Fisher Scientific，型号：SLA-1500）
8×50ml预冷角转子（例如，Beckman Coulter，型号：JA-20或Thermo Fisher Scientific，型号：SS-34）
榨汁机（厨房用具，如 Maginix Le duo XL）
离心机（对于50和250ml管）（例如Beckman Coulter或Sorvall ^TM）
油漆刷（软）
棉布或尼龙网（如，网格60-120μm）
塑料巴斯德移液器
烧杯
测量移液器
pH计
土豆削皮器
漏斗

程序

注意：

所有步骤应在0-4°C使用无洗涤剂的玻璃器皿或塑料！
我们将在这里描述从1kg的品种Folva的剥离的块茎中分离线粒体。这将产生8-12mg线粒体蛋白的最终产量。使用其他品种可以得到不同的产量。从均质化开始（点3）至冷冻约6小时的总时间。

预冷离心机转子。
加入半胱氨酸和BSA至提取缓冲液，调至pH 7.3。半胱氨酸是抗氧化剂，BSA结合脂肪酸和酚类物质，其可以干扰线粒体功能，BSA也作为蛋白酶底物有助于保护线粒体蛋白免受损伤
剥皮土豆并使用榨汁机（1kg给出约500ml果汁）使剥皮的马铃薯均质化，并使汁直接进入约1/2体积的提取介质（此处为250ml）。之后立即用2M KOH调节至pH7.2，或者对于较大的制剂，每kg均匀后调节至pH7.2
离开匀浆（总体积约750ml），静置5分钟，使淀粉沉淀
使用漏斗过滤两层棉花（或类似物），并转移到离心管中
将约190ml滤液转移到四个250ml离心管中的每一个中。平衡管，并在6×250ml预冷角转子中以3,000xg离心5分钟。
将上清液小心地倒入新鲜离心管中（避免转移沉淀），平衡并以18,000×g离心10分钟。
轻轻丢弃上清液，不影响沉淀，并使用油漆刷将每个沉淀重悬于1ml 1x甘露醇梯度缓冲液中。重悬浮颗粒的总体积为8-10ml。
使用塑料巴斯德移液器准备两个Percoll步骤梯度。避免混合条带通过轻轻地分层50％，然后28％和最后20％Percoll（所有在甘露醇）在彼此顶部在50ml离心管中。
轻轻地将粗级分（每个梯度4-5ml）在两个Percoll阶梯梯度的顶部上
使用8×50ml预冷角转子（见图1A）将平衡管和离心机在40,000×g下离心30分钟。
使用巴斯德移液管将线粒体带从每个管转移到新的50ml管中，用洗涤缓冲液填充至40ml并混合。
将两个管彼此平衡，并以18,000×g离心10分钟
小心地除去上清液，用洗涤缓冲液重悬浮非常松散的颗粒，用洗涤缓冲液填充至40ml并混合。
平衡并以18,000×g离心10分钟（参见图1B）
除去上清液，并使用油漆刷在1ml 1×甘露醇缓冲液中重悬浮非常松散的颗粒，并轻轻地在两个28％Percoll蔗糖梯度的顶部上。
平衡并使用8×50ml转子在40,000×g离心30分钟（见图1C）。
转移线粒体带到两个新鲜的50毫升离心管，填充达40毫升与洗涤缓冲液和混合。
以18,000×g离心10分钟。
小心地除去上清液并重复洗涤（如步骤13-14）沉淀（见图1D）。
除去上清液，并将每个沉淀重悬在500μl洗涤缓冲液中。加入5％（v/v）DMSO冷冻完整的细胞器。每个沉淀的最终体积为约800μl，含有4-6mg（总8-12mg）线粒体蛋白
快速冷冻和存储100-200微升在液氮中的等分试样。这样，如果在使用前不久快速解冻，线粒体保持其完整性和呼吸功能（见下文）数月。

图1.马铃薯块茎线粒体的Percoll梯度纯化。 A）。具有在28％-50％Percoll界面处的黄色线粒体条带和淀粉小球的步骤梯度（在步骤11之后）。 B）。从步骤梯度中除去线粒体带并洗涤（在步骤15之后）获得沉淀。暗中心由过氧化物酶体组成（Struglics等人，1993）。 C）。具有发白的线粒体带的连续梯度（在步骤17之后）。 D）。在从连续梯度中除去线粒体带并洗涤后（在步骤20之后）获得的最终沉淀物

代表数据

分离的线粒体的性质

使用该方案从马铃薯块茎分离的线粒体具有高度完整的外膜，如通过细胞色素c氧化酶的> 97％潜伏期所判断的，并且是高度纯化的，如通过细胞色素c氧化酶的高比活性（3.5μmolmg <-1> min ^-1）。使用单一底物（NADH，琥珀酸盐和苹果酸盐）在状态3（存在ADP）下的呼吸速率为150-350nmol O 2 mg -1 sup -1 min- 1 ，呼吸控制比为2.5-3.5，ADP/O比为1.7-2.0都取决于底物，制剂和栽培种。这与以前的研究完全一致（Neuburger等人，1982; Rasmusson和Møller，1990; Struglics等人，1993）。
通过western印迹判断线粒体是纯度> 95％（Salvato et al。，2014），其与先前研究中的标记酶和标记化合物的测量一致（Neuburger等et al。，，1982; Struglics et al。，，1993）。
使用一维聚丙烯酰胺凝胶电泳根据大小分离线粒体蛋白质，随后胰蛋白酶消化，通过液相色谱法分离胰蛋白酶肽和通过质谱鉴定总共鉴定了1,060种不同的蛋白质，包括以前在植物中未鉴定的约500种蛋白质线粒体（Salvato et al。，2014）。
类似的方法可用于从其他组织和物种中分离线粒体。然而，均质化方法可能必须改变，用于收集线粒体并进一步纯化它们的Percoll浓度（在此为28％）。参见Meyer和Millar（2008）关于从拟南芥细胞培养物中分离线粒体的方法。从绿叶分离线粒体更困难，因为大量叶绿体和类囊体膜从组织释放，并且拟南芥叶特别困难（Keech等人，2005）。

食谱

提取介质[600（300）ml，pH 7.3]

化学
集中
g/L

甘露醇
0.9 M
163.95

MOPS
30 mM
6.28

EDTA
3 mM
0.87

L-半胱氨酸
25 mM
3.03

BSA
0.3％（w/v）
3.00

将甘露醇，MOPS和EDTA溶于双蒸水（ddH 2 O）中
将pH调节至7.2，并将300ml转移至新容器以用作洗涤缓冲液
使用当天，向剩余的300ml中加入半胱氨酸和BSA，用KOH调节至pH7.3
洗涤缓冲液（900ml，pH 7.2）

化学
集中
g/L

甘露醇
0.3 M
54.65

MOPS
10 mM
2.07

EDTA
1 mM
0.29

使用提取介质（无半胱氨酸和BSA），并通过加入ddH 2 O稀释3倍
如果线粒体用于非蛋白质组学环境，则包括0.1％BSA。
梯度缓冲液
1. 2x甘露醇缓冲液（150ml，pH 7.2）
  
  化学
  集中
  g/L
  
  甘露醇
  0.6 M
  109.3
  
  MOPS
  20 mM
  4.14
  
  BSA
  0.2％（w/v）
  2.0
  
  每两步梯度使用35毫升，稀释剩余的115毫升2倍，用于重悬颗粒。
2. 2x蔗糖缓冲液（100ml，pH 7.2）
  
  化学
  集中
  g/L
  
  蔗糖
  0.6 M
  205.4
  
  MOPS
  20 mM
  4.14
  
  BSA
  0.2％（w/v）
  2.0
Percoll梯度
总体积35 ml，无样品
1. 渐变
  
  Percoll，％（v/v）
  ddH <2> O，％
  2x甘露醇缓冲液，％
  每张音量梯度，ml
  
  20
  30
  50
  17.5
  
  28
  22
  50
  11.67
  
  50
  -
  50
  5.83
2. 连续渐变
  
  Percoll，％（v/v）
  ddH <2> O，％
  2x甘露醇缓冲液，％
  每梯度体积，ml
  
  28
  22
  50
  35
  
  非常小心地将梯度梯度的三个层逐一（最高的第一个）以45度角保持50ml管，以避免混合

致谢

这项工作得到了丹麦自然科学研究自然科学委员会（至I.M.M.）和经合组织合作研究计划：可持续农业系统生物资源管理（2012年到J.J.T.的休会奖学金）的支持。
该方法公开在Neuburger等人（1982）中，并且是Neuburger等人（1982），Struglics等人所使用的方法的改编。（1993）和Considine等人（2002）。

参考文献

Considine，M.J.，Goodman，M.，Echtay，K.S.，Laloi，M.，Whelan，J.，Brand，M.D.and Sweetlove，L.J。（2003）。超氧化物刺激土豆线粒体中的质子泄漏，这与解偶联蛋白的活性有关。 J Biol Chem 278（25）：22298-22302
Keech，O.，Dizengremel，P。和Gardeström，P。（2005）。从拟南芥中制备叶线粒体 Physiologia Plantarum 124（4）：403-409。

Meyer，E.H。和Millar，A.H。（2008）。从植物细胞培养物中分离线粒体。 In：Posch（ed）。 Methods Mol Biol。 Humana Press。 vol。 425：2D PAGE：Sample Preparation and Fractionation，第2A卷。

Neuburger，M.，Journet，E.P.，Bligny，R.，Carde，J.P。和Douce，R。（1982）。 Percoll密度梯度中的等密度离心法纯化植物线粒体拱Biochem Biophys 217（1）：312-323。

Rasmusson，A.G。和Møller，I.M。（1990）。 NADP利用酶在植物线粒体基质中的应用植物生理学 94（3）：1012-1018。

Salvato，F.，Havelund，J.F.，Chen，M.，Rao，R.S.，Rogowska-Wrzesinska，A.，Jensen，O.N.，Gang，D.R.，Thelen，J.J.andMøller，马铃薯块茎线粒体蛋白质组植物生理学 164（ 2）：637-653。

Struglics，A.，Fredlund，K.M.，Rasmusson，A.G.andMøller，I.M。（1993）。完整马铃薯块茎过氧化物酶体膜中存在短的氧化还原链以及苹果酸脱氢酶与过氧化物酶体膜的结合。 > Physiologia Plantarum 88（1）：19-28