材料和试剂

N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-05131）
（Nak）（Funakoshi，目录号：04-621）。
N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸
o - 酞醛（OPA）（Nacalai Tesque，目录号：27824-74）
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：132-06471）
乙腈（Wako Pure Chemical Industries，目录号：015-08633）
三氯乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：203-04952）
氢氧化钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-15985）
0.4 M硼酸钠缓冲液（见配方）
1. 硼酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：021-02195）
2. 氢氧化钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-13775）
50 mM乙酸钠缓冲液（见配方）
1. 乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-01075）
2. 醋酸钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-01075）
50％TCA（参见配方）
1M NaOH（见配方）

设备

ACQUITY UPLC-FLR系统（Waters）
1. AccQ-Tag Ultra 2.1×100mm柱（Waters，目录号：186003837）
2. ACQUITY二进制溶剂管理器
3. ACQUITY示例管理器
4. ACQUITY FLR检测器
5. 样品瓶：12 x 32 mm玻璃螺丝颈瓶，Quick Thread，LectraBond盖，PTFE /硅胶隔片，Total Recovery（Waters，目录号：186000384c）
6. Empower 2软件
Vortex（Taitec，目录号：0061271-000）
聚四氟乙烯膜过滤器（4mm直径，0.2μm孔径）（Merck KGaA，目录号：SLLGH04NL）
Amicon Ulta 0.5ml离心过滤器3K装置（Merck KGaA，目录号：UFC500396）

软件

Empower 2软件

程序

使用含有衍生化试剂的两种甲醇溶液（A和B）使D，L-氨基酸与OPA和NAC（Aswad，1984）或NBC（Hashimoto等人，1992）注1-3）。这种衍生化导致荧光非对映异构体。甲醇溶液A通过将8mg的OPA和10mg的NAC溶解在1ml的甲醇中制备，而甲醇溶液B通过将10mg的OPA和10mg的NBC溶解在1ml的甲醇中制备。这些甲醇溶液A和B对光不敏感
用于衍生化的反应混合物（250μl）在样品瓶中含有25μl氨基酸样品，50μl甲醇溶液（A或B）和175μl0.4M硼酸钠缓冲液（pH 10.4）。涡旋反应混合物。要为样品选择正确的甲醇溶液，请参见注释2和3
在室温下在黑暗中荧光衍化2分钟后，将样品瓶放在UPLC系统的ACQUITY样品管理器的小瓶支架上。将反应混合物的等分试样（1μl）引入a UPLC系统自动执行。因为荧光衍生物不稳定，所以将等分试样引入UPLC系统应当在孵育后立即进行。
该系统在30℃下以0.25ml/min的流速操作。用于分析OPA-NAC衍生物[A = 50mM乙酸钠（pH5.9）和B =甲醇]的UPLC梯度系统为10-20％B，3.2分钟，20％B，1分钟，20-40％ 3.6分钟，40％B持续1.2分钟，40-60％B持续3.8分钟，60％B持续1分钟，60-10％B持续0.01分钟，然后系统用90％A和10％B平衡4.19分钟。需要约4.0ml的A和约2.7ml的B用于一个样品的分析。用于分析OPA-NBC衍生物[A = 50mM乙酸钠（pH5.9）和B =乙腈]的梯度系统为15-21％B 7分钟，21-27.5％B 1.5分钟，27.5％B 2分钟min，27.5-30％B持续1分钟，30-40％B持续2分钟，40％B持续0.5分钟，40-15％B持续0.01分钟，然后系统用85％A和15％B 3.99分钟。需要约3.8ml的A和约1.8ml的B用于一个样品的分析。用于非对映异构体氨基酸衍生物的荧光检测的激发和发射波长分别为350nm和450nm。在第一次分析之前，系统用上述平衡条件预平衡16分钟。
使用Empower 2处理数据，所述Empower 2是用于UPLC系统的控制和分析软件。峰高和保留时间分别用于氨基酸的定量和鉴定（见注4）。在分析生物样品的情况下，基于从对照氨基酸样品的分析提供的氨基酸的保留时间来进行氨基酸的鉴定。
标准曲线的标准溶液由4mM 32种氨基酸组成：天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu），丝氨酸（Ser），丙氨酸（Ala），亮氨酸（Leu），苯丙氨酸Phe，缬氨酸，Val，蛋氨酸Met，色氨酸Trp，精氨酸Arg，组氨酸His，苏氨酸Thr，天冬酰胺Asn，酪氨酸Tyr和谷氨酰胺Gln。 - 异亮氨酸（L-Ile）和D-异亮氨酸 - 异亮氨酸（D-allo-Ile）。将标准溶液在0.05M HCl中稀释至7个浓度（5,25,50,100,250,500和1,000μM），之后将溶液通过聚四氟乙烯膜过滤器（直径4mm，孔径0.2μm）过滤，）。基于从每种浓度的标准溶液的UPLC分析提供的色谱图，计算D或L-氨基酸的校准曲线，绘制峰高对氨基酸含量的曲线。 a的方程的计算校准曲线和样品中氨基酸的定量使用Empower 2软件进行

代表数据

柱温度的不稳定性负面影响两个相邻峰（例如，在OPA-NAC衍生化的情况下的D-组氨酸和L-组氨酸的峰）的分离的再现性。我们建议您将色谱柱温度精确保持在30°C。

笔记

在该方法中，化合物中的氨基是非对映异构体和荧光衍生化的目标，并且不仅氨基酸而且蛋白质用衍生化试剂衍生化。衍生的荧光蛋白引起污染的峰，并防止氨基酸的鉴定和定量。因此，应使用Amicon Ulta 0.5ml离心过滤器3K装置或三氯乙酸（TCA）处理通过过滤来消除样品中的蛋白质。
如下所述进行TCA处理。向500μl的样品溶液如生物样品和食品样品中加入125μl的50％TCA（参见Recipes）。在室温下温育5分钟后，将混合物离心（10,000×g，在4℃下15分钟），并且通过加入300μl的上清液中和等分试样（500μl）的上清液1M NaOH（参见配方）。当使用TCA处理后的样品进行UPLC分析时，通过聚四氟乙烯膜过滤器（直径4mm，孔径0.2μm）过滤样品溶液。
使用OPA-NAC衍生化，将Asp，Ser，Gln，His，Arg，Ala，Trp，Val，Met，Tyr，Phe，Leu，D-Thr，D-allo - 可以一次分析Ile和L-Ile（图1A）
使用OPA-NBC衍生化，Glu，Asn，Asp，Ser，Gln，Ala，Tyr，Val，Met，Phe，D-Thr，D-Arg，D-Leu，L-His，L - 可以一次分析Ile和L-Trp（图1B）
在使用OPA-NAC和OPA-NBC的分析中，当计算峰高相对于氨基酸含量（0.5至100pmol）的标准曲线时，在所有情况下观察到具有回归系数的线性0.998。

图1.游离氨基酸的NAC-OPA A和NBC-OPA B衍生物的色谱图。A.每个峰对应于100pmol的氨基酸。 B.每个峰对应于20pmol的氨基酸

食谱

0.4M硼酸钠缓冲液（pH 10.4,100ml）将2.47g硼酸与80ml超纯水混合用氢氧化钠将pH调至10.4 将超纯水加至100 ml
过滤（0.22μm）
在室温下贮存
50mM乙酸钠缓冲液（pH5.9,1L）将4.1g乙酸钠与900ml超纯水混合用乙酸将pH调至5.9 将超纯水加入1 L
过滤（0.22μm）
在室温下贮存
50％TCA
将25g TCA与30ml超纯水混合
将超纯水加入到50ml ml / 储存在4°C
1 M NaOH
将4.0g氢氧化钠与80ml超纯水混合将超纯水加至100 ml
在室温下贮存

致谢

在这种方法中，我们已经修改了Aswad和Hashimoto的使用OPA和手性硫醇（NAC和NBC）衍生化氨基酸的方法。此外，这项工作是由一个基础研究促进基金支持生物技术研究推进机构（BRAIN）和JSPS KAKENHI编号2402734的创新生物科学活动。

参考文献

Aswad，D. W.（1984）。在衍生化后，通过高效液相色谱法测定氨基酸混合物中的D-和L-天冬氨酸一种手性加合物 - 邻苯二醛。 Anal Biochem 137（2）：405-409。
& Hashimoto，A.，Nishikawa，T.，Oka，T.，Takahashi，K.and Hayashi，T。（1992）。通过高效液相色谱法测定大鼠脑和血清中的游离氨基酸对映异构体， H] - 叔丁氧基羰基-L-半胱氨酸和β-巯基乙醛。 58 Chromatogr 582（1-2）：41- 48.