材料和试剂

RAW 264.7细胞（ATCC，TIB-71）
E。大肠杆菌 CFT073或其他细菌菌株
LB肉汤（Beckton Dickinson，目录号：244610）
琼脂（Beckton Dickinson，目录号：214010）
RPMI1640（Life Technologies，目录号：11875-093）
庆大霉素50mg/ml（Life Technologies，目录号：15750-102）
PBS（pH 7.4）
LB板（见配方）
认证的热灭活胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10082139）（参见配方）
100x青霉素，链霉素和谷氨酰胺（PSG）（Life Technologies，目录号：10378-016）（参见Recipes）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：8047-15-2）（参见Recipes）

设备

24孔板（Corning，Costar ，目录号：3524）
0.22微米过滤器（Millipore，目录号：SCGP00525）
37℃，5％CO 2培养箱
Sorvall Legend RT台式离心机
Shimadzu UV-1601PC分光光度计

程序

将RAW264.7细胞在含有10％热灭活的胎牛血清和1×青霉素链霉素和谷氨酰胺的RPMI1640中在37℃下在CO 2培养箱中培养。
使用标准程序计数细胞，并通过在24孔板中每孔加入1ml将种子以2×10 5个RAW细胞/孔接种。设置2块板; 一个用于T0，另一个用于T2，并在CO 2培养箱中孵育
开始在10毫升聚丙烯管中的3ml LB肉汤中的CFT073的过夜培养物，并在37℃下以200rpm振摇孵育。使用其他细菌菌株时，使用适当的培养基
确定感染的多重性（MOI =每个RAW 264.7细胞的细菌数），并相应地改变接种制剂。对于MOI为10，加入2×10 6 cfu的E。大肠杆菌 CFT073用于含有2×10 5个 RAW细胞的孔。
通过在Sorvall离心机中以4,000rpm离心10分钟从3ml培养物中沉淀细菌细胞。在3ml PBS中重新填充沉淀
通过在分光光度计中测量1:10稀释的培养物的光密度并计算未稀释的培养物的光密度，将肉汤培养物的OD 600调节至PBS中的4倍。
在PBS中稀释1：100
在无抗生素的RPMI 1640中稀释1:10
用PBS洗涤RAW细胞两次。
向每个孔中加入1ml稀释的培养物; 推荐每个样品三个技术重复和整个实验的三个生物学重复。对T0和T2板使用相同的设置。
在37℃，5％CO 2孵育30分钟
吸出上清液，用PBS洗涤3次
每孔加入1ml含庆大霉素（200μg/ml）的RPMI 1640
将T0板在37℃，5％CO 2孵育15分钟
在37℃，5％CO 2孵育T2板2小时
15分钟或2小时后，通过抽吸完全去除上清液
通过在室温下孵育10分钟，随后强烈吸液，用1ml过滤灭菌的H 2 O 2 /孔中的1％皂苷溶解细胞。使用标准倒置确定溶解的程度显微镜
未稀释的板和在LB板上的T0和T2时间点的-2稀释
％杀灭= [（T0-T2）/T0]×100

食谱

LB平板
将15g琼脂加入1L LB肉汤中
FBS和PSG
分别以10％和1x最终浓度加入RPMI1640
皂苷
溶解在高压灭菌的双蒸水中，并使用0.22μM过滤器过滤灭菌

致谢

该协议改编自出版物：Subashchandrabose等人（2013）。

参考文献

Subashchandrabose，S.，Smith，S.N.，Spurbeck，R.R.，Kole，M.M.and Mobley，H.L。（2013）。全基因组检测uropathogenic中的适应基因大肠杆菌在全身感染期间。
9（12）：e1003788。