材料和试剂

纯化的蛋白质作为配体（纯度> 90％）（1ml，至少20μg/ml）
纯化的脂质作为分析物（最小300μl，2mg/ml）
10mM乙酸缓冲液（pH4〜5.5）（GE Healthcare，目录号：BR-1003-49〜52）
过滤的去离子水
200 mM NaOH
HBS-EP缓冲液（GE Healthcare，目录号：BR-1001-88）（参见Recipes）
胺偶联试剂盒组分（GE Healthcare，目录号：BR-10000-50）（参见Recipes）
再生侦查套件组件（GE Healthcare，目录号：BR-1005-56）（参见配方）

设备

Biacore 3000系统（GE Healthcare）
可用于胺偶联反应的羧基的CM 5传感器芯片（研究级）（GE Healthcare，目录号：BR-1003-99）
玻璃小瓶（9毫米）
玻璃小瓶（16 mm）
1.5ml离心管
超声波仪（Branson Bath型超声波发生器，型号：5510）

软件

BiaEvaluation软件（GE Healthcare）

程序

试剂的制备
1. 根据说明书数据表制备胺偶联试剂盒的试剂（将EDC和NHS溶解在10ml过滤的去离子水中，分别得到400mM和100mM的溶液）。
2. 使所有其他试剂（1.0M乙醇胺-HCl，HBS-EP缓冲液，乙酸盐缓冲液和再生侦测试剂盒溶液）温热至室温，（22-25℃）。
pH检测
pH侦测允许确定用于配体固定的最佳pH和离子强度。当使用羧甲基化葡聚糖基质（CM）传感器时，该步骤是必需的。
1. 将传感器芯片装入Biacore仪器（按照仪器的手册）。
2. 将HBS-EP缓冲区设置为运行缓冲区。
3. 在Biacore控制软件中设置固定pH侦测功能。
4. 通过在不同pH（4.0,4.5,5.0和5.5）的10mM乙酸盐缓冲液中稀释配体至最终浓度为20-200μg/ml，制备100μl配体溶液。
5. 注入80μl的每个配体溶液，并确定最佳的pH，其中观察到最高的预浓度反应（图1）。在每个配体注射后，用运行缓冲液（已经在pH侦测功能中建立）洗涤传感器芯片表面。
6. 在pH研究结束时，注射220μl的1M乙醇胺-HCl。执行该再生步骤以从传感器芯片表面完全去除配体注意：根据要相互作用的分子类型，运行哪种测定法以及使用的传感器芯片类型，选择运行缓冲液。在这种情况下，建议使用不含伯胺基团或强亲核基团（例如乙酸钠）和低离子强度（例如10mM）的缓冲液进行静电吸引。
  如果两个pH条件产生类似的预浓缩结果，则选择较高的pH以避免配体变性或沉淀。
图1. pH检测传感图A和结果报告B显示由配体产生的响应。在这种情况下，4.5是配体固定的最佳pH。 Y轴变量说明配体注射后共振单位（RU）的响应，X轴变量显示所有注射的时间。
配体的固定化
1. 在Biacore控制软件中打开固定应用程序，并设置您的模板用于固定。
2. 使用您在步骤B中选择的pH，在乙酸盐缓冲液中制备配体
3. 用EDC，NHS和乙醇胺-HCl溶液制备小瓶。所需的配体和溶液（EDC，NHS和乙醇胺-HCl）的体积显示在固定化应用中，并且取决于将使用多少流动池（图2）。
4. 运行固定程序。应用程序将注入EDC/NHS混合物（1：1）以激活芯片表面进行配体固定，然后注入配体溶液。最后，注射乙醇胺-HCl以洗去未结合的配体并使剩余的活性羧基失活
5. 检查固定结果（图3），根据表面的分析物结合能力而不是观察到的响应单位评价响应。最佳固定水平取决于配体和分析物的相对分子量。对于该方案，将配体固定固定为7,000RU。结合能力取决于分析物的分子量与传感器芯片表面上配体位点的数目的关系。图3中显示的配体的结合能力为〜118RU。
  注意：如果您要对多个配体使用相同的分析物，则可以在继续执行步骤C4之前将其固定。此时，您可以停止实验并将传感器芯片存储在4°C。
图2.固定模板示例，显示运行固定程序所需的体积解决方案

图3.传感图A和配体固定的结果报告B. 响应1显示在注射后结合到表面的配体的量，反应2说明在表面失活后共价固定的配体的最终量。 />
分析物制备
1. 在25℃下超声处理（40kHz）LPS或脂质A的储备液15分钟。由于LPS倾向于聚集，所以在准备分析物样品之前对LPS和脂质A溶液进行超声处理是重要的
2. 在HBS-EP缓冲液中制备所需浓度的分析物。在我们的情况下，LPS以5,10,25,50,100和200μg/ml和3,6,10,15,20,30,40,50μg/ml的脂质A稀释。
再生条件
再生侦测允许确定从传感器芯片表面上的配体中除去结合的分析物的最佳条件。该步骤对于成功的结合测定是重要的;它允许鉴定将完全去除分析物而不破坏配体活性的合适的再生溶液。需要确定每种分析物的再生条件。
1. 在Biacore控制软件中打开再生侦查应用程序。
2. 注射最高分析物浓度（例如 200μg/ml）
3. 测试缓冲区，从最温和的开始。首先注射pH 3.0,2.5,2.0和1.5的甘氨酸缓冲液60秒。如果反应水平没有回到基线水平（分析物注射前的反应），则继续测试其他缓冲液。优化表面与再生缓冲液的接触时间，缓冲液注射次数和基线稳定期将有助于确定最佳再生条件。在我们的情况下，对于LPS，使用20mM NaOH洗涤5分钟，对于脂质A使用150mM NaOH洗涤5分钟，然后用HBS-EP缓冲液洗涤2分钟（图4）。
5. 再生条件
  再生侦测允许确定从传感器芯片表面上的配体中除去结合的分析物的最佳条件。该步骤对于成功的结合测定是重要的;它允许鉴定将完全去除分析物而不破坏配体活性的合适的再生溶液。需要确定每种分析物的再生条件。
  1. 在Biacore控制软件中打开再生侦查应用程序。
  2. 注射最高分析物浓度（例如 200μg/ml）
  3. 测试缓冲区，从最温和的开始。首先注射pH 3.0,2.5,2.0和1.5的甘氨酸缓冲液60秒。如果反应水平没有回到基线水平（分析物注射前的反应），则继续测试其他缓冲液。优化表面与再生缓冲液的接触时间，缓冲液注射次数和基线稳定期将有助于确定最佳再生条件。在我们的情况下，对于LPS，使用20mM NaOH洗涤5分钟，对于脂质A使用150mM NaOH洗涤5分钟，然后用HBS-EP缓冲液洗涤2分钟（图4）。
  4. ... Washing conditions: Use the previously optimized regeneration conditions.
  5. Blank control: An activated and blocked flow-cell without immobilized ligand is necessary as a reference to evaluate nonspecific binding.
  6. Negative control: Additionally to the blank, it is recommended to use a non-relevant protein of similar size of your ligand as a negative control of binding. This second control is helpful to validate your experiment since the stickiness of lipids may give false binding results.
    Once you have established your experimental conditions, proceed to perform your binding assay, you can use the binding analysis application provided with Biacore control software or customize your own application and templates following instrument’s manual. Typical results obtained in a lipid binding assay are exemplified in Figure 5.
    Note: If using a new chip perform 3-5 cycles of binding before starting your real experiment to verify whether ligand-analyte interaction response is steady.
  Figure 5. Sensorgram of protein-lipid (LPS) binding assay. In this example, binding experiment was performed at the same time with three different proteins.
6. 绑定分析
  然后使用BIA评估软件（遵循软件手册说明书-GE Healthcare）分析收集的数据。图6显示了蛋白质 - 脂质结合测定分析后获得的结果的实例。一式三份进行的实验得到相似的结果。
  
  图6.蛋白质 - 脂质（LPS）相互作用的最终传感图
笔记
1. 由于脂质固有的粘性，强烈建议在结合实验后彻底清洗仪器（解吸和消毒），以清除Biacore系统回路中残留的痕量分析物。
2. 如果通过SPR分析几种配体和分析物，建议至少有两个传感器芯片。在调节再生条件时，如果一个或多个配体损坏，预见传感器芯片料是有用的
食谱
1. HBS-EP缓冲区
  0.01 M HEPES（pH 7.4）
  0.15 M NaCl
  3 mM EDTA
  0.005％（v/v）P20表面活性剂
2. 胺偶联套件组件
  750mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC） 115mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 10.5ml 1.0M乙醇胺-HCl（pH8.5）
3. 再生侦测套件组件
  11 ml乙二醇（p.a.） 11ml 10mM甘氨酸-HCl（pH1.5） 11ml 10mM甘氨酸-HCl（pH2.0） 11ml 10mM甘氨酸-HCl（pH2.5） 11ml 10mM甘氨酸-HCl（pH3.0） 11ml 4.0M氯化镁
  11ml 0.2M氢氧化钠
  11ml 0.5％十二烷基硫酸钠（SDS）
  11ml 5.0M氯化钠
  20ml表面活性剂P20
致谢

作者希望感谢索菲亚农业生物技术研究所（ISA）的分析生物化学设施，以便接近Biacore系统。这项工作由ANR（ANR-07-BLAN-0214和ANR-12-EMMA-00O7-01），CNRS和 INRA。

参考文献
1. Baron，O.L.，van West，P.，Industri，B.，Ponchet，M.，Dubreuil，G.，Gourbal，B.，Reichhart，J.M.and Coustau，C。抗微生物蛋白LBP/BPI的家长转移保护了鸡眼疟原虫卵菌感染。 PLoS Pathog 9（12）：e1003792。