淀粉颗粒（SG）可以被视为紫色颗粒。

材料和试剂

水稻种子
Technovit 7100树脂（Heraeus Kulzer）
Lugol溶液（MP Biomedicals，目录号：155269）
福尔马林
乙酸
99.5％乙醇（可商购的）
速溶胶粘剂（Aron alpha，Toagosei Co.）
FAA解决方案（参见配方）
100％乙醇（见配方）
100％Technovit 7100（I）（见配方）
25％Technovit 7100树脂（I）（参见配方）
50％Technovit 7100树脂（I）（参见配方）
75％Technovit 7100树脂（I）（参见配方）
100％Technovit 7100（II）（见配方）

设备

硅烷化载玻片（Dako，目录号：S3003）
木钉（6 x 25毫米）
剃刀刀片（羽毛，目录号：FH-10）
1.5 ml塑料管
0.2 ml PCR管
分子筛4A 1/16（Nacalai tesque，目录号：04172-95）
超微切片机（Leica Microsystems，型号：EM UC7）
金刚石刀（Diatome AG，Ultra trim，3.0mm）
旋转器（TAITEC，型号：RT-30mini）
钳（Vigor，不锈钢＃5）
抽吸器（Ulvac，型号：MDA-015）
显微镜（OLYMPUS，型号：AX70）

图2.木榫

程序

胚乳的树脂包埋
1. 使用刀片从糙米种子胚乳的中心区域切出大约1毫米立方体块
2. 将块放入一个空的1.5毫升塑料管。
3. 加入500μl的FAA溶液到塑料管中。块应该在管的底部下沉。
4. 使管打开，将其放置在吸气器中并真空5分钟。
5. 轻轻释放负压。
6. 重复步骤4和5两次以上。
7. 从吸气器取管，用微量移液管取出FAA
8. 将1ml新鲜的FAA溶液加入试管中
9. 在室温下以30转/分钟旋转过夜
10. 取出FAA，加入1ml 30％乙醇
11. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
12. 除去30％乙醇，加入1ml 50％乙醇
13. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
14. 除去50％乙醇，加入1ml 70％乙醇
15. 15.在室温下以30转/分钟旋转1小时
16. 除去70％乙醇，加入1ml 90％乙醇
17. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
18. 除去90％乙醇，加入1ml 95％乙醇
19. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
20. 除去95％乙醇，加入1ml 100％乙醇
21. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
22. 交换100％乙醇，并以30转/分钟旋转1小时
23. 交换100％乙醇，并在室温下以30转/分钟旋转过夜
24. 交换100％乙醇，在室温下以30转/分钟旋转1小时
25. 除去100％乙醇，加入1ml 25％的Technovit 7100树脂（I）在室温下以30转/分钟旋转1小时。
26. 除去25％Technovit 7100树脂（I），并加入1mL 50％Technovit 7100树脂（I）。
27. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
28. 除去50％Technovit 7100树脂（I），并加入1ml 75％Technovit 7100树脂（I）。
29. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
30. 除去75％Technovit 7100树脂（I），并加入1ml 100％Technovit 7100树脂（I）。
31. 在室温下以30转/分钟旋转1小时
32. 交换100％Technovit 7100树脂（I）并在室温下以30转/分钟旋转1小时
33. 交换100％Technovit 7100树脂（I）并在室温下以30转/分钟旋转过夜
34. 交换100％Technovit 7100树脂（I）并在室温下以30转/分钟旋转1小时
35. 在室温下从管中除去100％Technovit 7100树脂（I）
36. 将胚乳块转移到0.2-ml PCR管中。一个PCR管应该包含一个胚乳块
37. 在PCR管中加入150-200μl的100％Technovit 710（II）
38. 确认胚乳块沉淀在PCR管的底部。如果漂浮，尝试通过移液器发送到底部。
39. 在37℃下孵育PCR管2天以上以固化树脂
修整固化树脂
1. 用刀片从固化的树脂上取下PCR管
2. 用刀片修整固化的树脂，以除去额外的树脂。保持胚乳块嵌入的部分完好无损。
3. 通过瞬间超级粘合剂将修剪的树脂粘在木销钉上。
薄切片和染色
1. 将木钉固定在超薄切片机的样品架上，使树脂朝外。
2. 将菱形刀放在超薄切片机上。
3. 调整榫钉和金刚石刀的角度，方向和位置，使刀口能够在适当的方向接近树脂中的胚乳块。
4. 通过在每个金刚石刀的位置前1微米开始树脂切片
5. 继续切片树脂以获得含有胚乳块的薄切片
6. 在硅烷化的载玻片上准备一滴水。
7. 用镊子取出含有胚乳块的薄切片
8. 将薄片放在幻灯片上的水滴表面。薄部分将在水面上膨胀。
9. 将薄片在室温下放置过夜以干燥水。
10. 在粘在载玻片上的干薄片上加入一滴40倍稀释的Lugol溶液。
  注意：染色部分需要1-5秒。而且没有必要以在显微镜下观察之前除去染料。
11. 在染色部分装上盖玻片。
  注意：不需要特殊的安装试剂。其余的染料作为固定试剂。
12. 在正常光学显微镜下检查切片。

食谱

FAA解决方案
1ml福尔马林
1ml乙酸 9ml 99.5％乙醇 9ml H 2 O 2 /
100％乙醇
500ml乙醇（99.5％，市售）约100g分子筛4A 1/16
100％Technovit 7100（I）
10 ml Technovit 7100
0.1g硬化剂I
25％Technovit 7100树脂（I）
250μl100％Technovit 7100（I）
750μl100％乙醇
50％Technovit 7100树脂（I） 500μl100％Technovit 7100（I）
500μl100％乙醇
75％Technovit 7100树脂（I） 750μl100％Technovit 7100（I）
250μl100％乙醇
100％Technovit 7100（II）
1 ml Technovit 7100（I）
66μl固化剂II

致谢

这项工作由教育，文化，体育，科学和技术促进科学研究资助部（第23770046号）资助。这项工作也得到以下基础的支持： Iijima纪念基金会，日本奖基金会，Shorai科学技术基金会，Wesco科学促进基金会，Towa食品研究基金会，Skylark食品科学研究所基金会和Oohara基金会。

参考文献

Matsushima，R.，Maekawa，M.，Fujita，N.and Sakamoto，W。（2010）。一种快速，直接的观察方法，用于分离具有水稻淀粉颗粒形态缺陷的突变体。 Plant Cell Physiol 51（5）：728-741
Matsushima，R.，Yamashita，J.，Kariyama，S.，Enomoto，T.，Sakamoto，W。（2013）。系统发育学重新评估形态学变异应用糖科学 60：37-44。
Matsushima，R.，Maekawa，M.，Kusano，M.，Kondo，H.，Fujita，N.，Kawagoe，Y.and Sakamoto，W.（2014）。淀粉体本地化的SUBSTANDARD STARCH GRAIN4蛋白影响水稻胚乳中淀粉颗粒的大小。植物生理学 164（2）：623-636。