材料和试剂

小鼠（成年人> 6周，任何菌株，例如用于MOG诱导的EAE的C57BL/6）
戊巴比妥钠（euthatal）（Merial）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
10x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
RPMI溶液（Sigma-Aldrich，目录号：R0883）
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
FBS（Sigma-Aldrich，目录号：F9665）
补充有3％FBS的Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H9394）
胶原酶D（Roche，目录号：11088858001）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：D4263）
Percoll Plus（Sigma-Aldrich，目录号：17-5445-01）
细胞渗透试剂盒（含有IntraStain试剂A和B）（Dako，丹麦，目录号：K2311）
佛波醇肉豆蔻酸乙酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
布雷菲德菌素A（BFA）（Sigma-Aldrich，目录号：B7651）
LIVE/DEAD ^® Fixable Aqua死细胞染色试剂盒（Life Technologies，目录号：L34957）
CD16/CD32FcγRIII（BD Biosciences，目录号：553141）
FACS抗体（视情况而定）
碘化丙啶（PI）（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）
完成RPMI解决方案（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）
原料等渗percoll（SIP）（参见Recipes）。

设备

70μm尼龙网过滤器（Corning，目录号：352350）
振荡器，在37℃下能够达到200rpm。
组织培养设施包括II级层流罩
台式离心机，优选冷藏（任何型号）
流式细胞仪

软件

Summit软件（Dako）
FlowJo软件（Tree Star）

程序

用戊巴比妥钠麻醉麻醉小鼠（40μli.p.）并用无菌冰冷PBS（20ml）心内灌注。这是通过使用20ml注射器缓慢且稳定地将冰冷的PBS注射到心脏的左心室中来实现的。
通过用锋利的剪刀切除头骨，用镊子轻轻地除去大脑，并放置在1ml完全RPMI溶液（或可以使用补充3％FBS的HBSS）中解剖大脑。
通过使用5ml注射器的柱塞迫使组织通过无菌的70μm尼龙网过滤器，用完全RPMI溶液洗涤并以280×g离心5分钟来制备单细胞悬浮液。
除去上清液和剩余的沉淀并重悬于含有胶原酶D（1mg/ml）和DNAse I（10μg/ml）的完全RPMI（2ml）中，并在37℃下搅拌温育1小时。
用完全RPMI洗涤细胞并在280×g离心5分钟。弃去上清液并将细胞重悬于40％Percoll [5ml; PBS中的40％储备等渗percoll（SIP）; 1.052g/ml]。
小心地在70％Percoll（5ml; 70％SIP在PBS中; 1.088g/ml）顶上的细胞悬浮液。
离心机关闭制动器时，以600 x g离心20分钟。
通过用无菌塑料移液管吸出，从1.088：1.052 g/ml接口中取出单核细胞，在完全RPMI中洗涤两次并计数。
将样品以280×g离心5分钟，并在存在PMA（10ng/ml），离子霉素（1μg/ml）的情况下，将细胞在37℃下在无菌FACS管中在完全RPMI中温育。和BFA（5μg/ml）处理5小时
5小时后，通过在280×g离心细胞5分钟来洗涤细胞，准备使用细胞透化试剂盒进行细胞内染色。
重悬在50μlPBS与1：1,000 LIVE/DEAD可固定水族死细胞染色试剂盒在4℃下20分钟。
在FACS缓冲液中洗涤细胞，并重悬于含有CD16/CD32FcγRIII（1:100）的50μlFACS缓冲液中，并在4℃下孵育10分钟以封闭低亲和力IgG受体。
孵育细胞在50微升/含有适当的FACS抗体的样品FACS缓冲液在4℃下15分钟
使用IntraStain试剂A（50μl/样品）在室温下固定细胞15分钟，用FACS缓冲液洗涤两次并在280×g离心5分钟。
使用IntraStain试剂B（50μl/样品）包括细胞内抗体在室温下在黑暗中透过细胞15分钟。
在FACS缓冲液中洗涤细胞两次，并在280×g离心5分钟。
仅将表面染色的单核细胞阻断10分钟，如上所述在4℃下用合适的抗体温育15分钟，在FACS缓冲液中洗涤两次，并在280×g离心5分钟。 PI可以在流式细胞仪上读取样品之前立即通过加入1:100来用作活/死染色（仅具有表面染色）。
在流式细胞仪上进行流式细胞术分析，并使用Summit软件获取数据。使用FlowJo软件分析结果。代表性数据可参见下面的参考文献1和2。

食谱

完成RPMI解决方案
补充有1％青霉素 - 链霉素，1％L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI溶液注意：补充了3％FBS的HBSS可以代替完整的RPMI溶液。
FACS缓冲区
补充有2％FBS的PBS
股用等渗Percoll（SIP）
9份Percoll加（来自瓶），1份10x PBS

致谢

这项工作是由科学基金会爱尔兰的金斯顿米尔斯的PI拨款资助。

参考文献

Browne，T.C.，McQuillan，K.，McManus，R.M.，O'Reilly，J.A.，Mills，K.H.and Lynch，M.A。（2013）。淀粉状蛋白β特异性Th1细胞的IFN-γ产生促进小胶质细胞活化并增加小鼠的斑块负荷模型的阿尔茨海默病。 Immunol 190（5）：2241-2251。
Sutton，C.E.，Lalor，S.J.，Sweeney，C.M.，Brereton，C.F.，Lavelle，E.C。和Mills，K.H。（2009）。白细胞介素-1和IL-23诱导来自gammadelta T细胞的天然IL-17产生，扩增Th17应答和自身免疫。免疫 31（2）：331-341。