材料和试剂

C57BL/6小鼠（成年，> 6周龄;通常每次实验4次）
Aβ1-42肽（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：03112）
CpG（CpG-寡脱氧核苷酸1668; 5'-tccatgacgttccgatgct-3'; Sigma-Genosys）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
IL-1（Immunotools，目录号：12340013）

材料和试剂

C57BL/6小鼠（成年，> 6周龄;通常每次实验4次）
Aβ1-42肽（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：03112）
CpG（CpG-寡脱氧核苷酸1668; 5'-tccatgacgttccgatgct-3'; Sigma-Genosys）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
IL-1（Immunotools，目录号：12340013）

₂

RPMI medium (Sigma-Aldrich, catalog number: R0883)
Penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, catalog number: P4333)
L-glutamine (Sigma-Aldrich, catalog number: G7513)
FBS (Sigma-Aldrich, catalog number: F9665)
Complete RPMI medium (see Recipes)

Equipment

Shaker capable of 200 rpm at 37 °C
24-well cell culture plates (Greiner Bio-one, catalog number: 662160)
1 ml tuberculin syringes (BD, catalog number: 300013)
70 μm nylon mesh filter (Corning, catalog number: 352350)
Tissue culture facilities including class II laminar flow hood
离心机

程序

在HPLC级水中溶解Aβ1-42肽以提供12mg/ml储备溶液，使用无菌PBS将其稀释至2mg/ml，并使其在37℃下聚集48小时和200rpm的搅拌。 Aβ1-42立即使用或储存在-20℃下。
通过在50μl总体积中用Aβ1-42（75μg/小鼠）和CpG（25μg/小鼠）皮下注射到后足垫中来免疫C57BL/6小鼠，/em> 25μl/英尺
在21天后用相同剂量的抗原和佐剂进行持续（加强）免疫。
再过7天后，处死小鼠，取出al淋巴结（引流淋巴结，参见图1）和脾。

图1。 al淋巴结示意图
通过无菌的70μm尼龙网过滤器分离淋巴结和脾组织，用完全RPMI洗涤并在280×g离心5分钟并进行细胞计数。
在细胞因子和抗体的存在下，根据细胞系的类型，用Aβ1-42（25μg/ml）在2×10 6个细胞/ml下刺激细胞需要。为了产生Th1细胞，用Aβ1-42（25μg/ml）和IL-12（10ng/ml）刺激来自淋巴结和脾的细胞。使用地塞米松（1×10 8 -8 M），IL-4（10ng/ml）和抗-IFNγ（5mg/ml）扩增Th2细胞，并用IL产生Th17细胞-1（10ng/ml），IL-23（10ng/ml）和抗-IFNγ（5mg/ml）。
4天后，向Th1和Th2细胞培养物中加入IL-2（5ng/ml），或仅对Th17细胞加入培养基，继续培养7天。
用完全RPMI洗涤细胞，在280×g离心5分钟并计数。
通过对IFN-γ，IL-5或IL-17进行细胞内细胞因子染色和FACS分析或通过ELISA测定上清液中这些细胞因子的量来确认细胞被极化为Th1，Th2或Th17。
注射细胞i.p。向100μl无血清培养基或PBS中的受体小鼠（通常为1.5×10 7个细胞/小鼠）中。

食谱

完成RPMI培养基
补充有1％青霉素 - 链霉素，1％L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI培养基中

致谢

这项工作是由科学基金会爱尔兰的金斯顿米尔斯的PI拨款资助。

参考文献

Browne，T.C.，McQuillan，K.，McManus，R.M.，O'Reilly，J.A.，Mills，K.H.and Lynch，M.A。（2013）。 IFN-γ由淀粉状蛋白β特异性Th1细胞的产生促进小胶质细胞活化并增加小鼠的斑块负荷模型的阿尔茨海默病。 Immunol 190（5）：2241-2251。
McQuillan，K.，Lynch，M.A。和Mills，K.H。（2010）。通过Abeta特异性Th1和Th17细胞激活混合型胶质细胞及其通过Th2细胞的调节。 a> Brain Behav Immun 24（4）：598-607。