材料和试剂

特定细菌[例如大肠杆菌（E.coli），ATCC，目录号：25922; < em>绿脓假单胞菌（铜绿假单胞菌），ATCC，目录号：27853）]
3％Todd-Hewitt（TH）肉汤
3％TH琼脂平板上
人类柠檬酸血浆（新鲜）
50mM Tris/HCl（pH7.4，无菌）
50mM ZnCl 2在H 2 O（无菌）中的溶液
显色底物S-2302（Chromogenix，目录号：S820340）（4mM，在H 2 O中）
DAPTTIN TC（Technoclone，目录号：5035060）
肽（例如抗微生物肽LL-37）或其他待测试剂

设备

微量离心管
BD vacutainer ^®加采血管（BD，目录号：364305）
96孔平底板
离心机用微量离心管
ELISA读数器（A = 405nm）
培养箱37℃

程序

用细菌测试
第1天
1. 在新鲜的10ml 3％TH培养基中，在37℃下，以200rpm振荡，使细菌生长过夜第2天
2. 在新鲜的10ml 3％TH培养基中加入100μl过夜培养细菌并在37℃将传代细菌传代至中指数期（OD <620>〜0.5）和200rpm
3. 离心细菌（10分钟，5,000rpm）并除去上清液
4. 用10ml 50mM Tris/HCl（pH7.4）洗涤细菌沉淀两次
5. 将细菌沉淀物在50mM Tris/HCl（pH 7.4）+50μMZnCl 2中重悬至终浓度为2×10 9 cfu/ml。
  注意：为了获得2×10 ⁹ cfu/ml，特定细菌的生长曲线必要的，为了知道需要多少体积的重悬，在进行实验之前。
  取100微升细菌，与10微升测试试剂或缓冲液（阳性对照）在室温孵育60秒。
  注意：
  1. 阴性对照仅含100μl细菌，与100μl50 mM Tris/HCl（pH 7.4）混合，而不是血浆。
  2. 孵育时间和底物量可能需要调整根据所测试的特定细菌（Papareddy等人，2013年）。
6. 向样品中加入100μl柠檬酸盐血浆
7. 在37℃下在200rpm转速下孵育35分钟
8. 旋转细菌（6分钟，5,000 rpm），并清洗细菌用50mM Tris/HCl（pH 7.4）（100μl/样品）沉淀一次
9. 重悬于100μl50mM Tris/HCl（pH 7.4）+50μMZnCl 2缓冲液含有2mM发色底物S-2302（混合好）
10. 在37°C孵育样品30-60分钟（检查黄色在阳性对照中的发展，发色团切割的指示并与酶解离），以确定孵育时间
11. 离心样品（6分钟，5000rpm），并将上清液转移到96孔板中
12. 测量405nm处的吸光度。值相对于阳性对照（定义为100％）呈现。
无细菌测定
1. 孵育10微升所需的代理与100微升Dapttin在室温60秒
2. 加入100微升人类柠檬酸盐血浆，并在室温下孵育样品3分钟
3. 离心沉淀（6分钟，5,000 rpm），并在50 mM中洗涤两次 Tris/HCl（pH7.4），然后悬浮于100μl50mM Tris/HCl（pH7.4）+中 50μM含有2mM发色底物S-2302的ZnCl 2缓冲液。
4. 在室温下孵育30分钟。
5. 离心样品。
6. 测量上清液在405nm的吸光度。值呈现相对于阳性对照（定义为100％）注意：
  1. 对于阴性对照，加入100μl的50mM Tris/HCl（pH 7.4）而不是在步骤B2中加入100μl人柠檬酸盐血浆。但，其他一切都与步骤B1-6相同。
  2. 孵育时间用于底物的裂解和随后的显色不同。如果颜色的发展是低，浓度底物可以增加。

致谢

该协议改编自Papareddy等人（2013）。

参考文献

Papareddy，P.，Kalle，M.，Sorensen，O.E.，Malmsten，M.，Morgelin，M。和Schmidtchen，A。（2013）。 TFPI-2衍生肽EDC34可改善革兰氏阴性脓毒症的结果。 PLoS Pathog 9（12）：e1003803。