材料和试剂

<蜡>芽孢杆菌 HYC-7
大肠杆菌（大肠杆菌）DH5α菌株，噬菌体T7
草甘膦（Sigma-Aldrich，目录号：PS1051）
胰蛋白胨（Difco）
酵母提取物（Difco）
氨苄西林
二盐酸二噻吩（Sigma-Aldrich，目录号：D3252）
辣根过氧化物酶（Sigma-Aldrich，目录号：P6782）
pGEX-6P-1（质粒全长4,984bp）的蛋白质表达载体（GE Healthcare，目录号：28-9546-48; Genbank登录号：U78872.1）
重组质粒pGEX-GO含有来自蜡状芽孢杆菌 HYC-7的甘氨酸氧化酶的编码基因核苷酸序列（1,110bp）提交NCBI Genbank并获得登录号（KC203486.1）。
Taq DNA聚合酶（Takara，目录号：R500A）
（Takara，目录号：1235A）。
dATP，dTTP，dCTP，dGTP（Takara，目录号：4026Q，4029Q，4028Q，4027Q）
TransStart FastPfu DNA聚合酶（TransGen Biotech，目录号：AP221-01）
高纯dNTP（TransGen Biotech，目录号：AD101-01）
Luria-Bertani培养基（见配方）

设备

96深孔板（Axygen，目录号：P-DW-20-C-S）
凝胶纯化柱（Axygen）
Thermo Multiskan光谱板读数器（Thermo Scientific，目录号：51118600）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：186-1096）
超声波处理器（Sigma-Aldrich，目录号：Z412619-1EA）

程序

随机诱变

如下制备扩增混合物（100μl）：
10μl10×Taq 缓冲液（Mg ^{2 +}加）
5μl10mM Mn 2+ 2 +
2μl10mM dGTP和dCTP 1μl10mM dATP和dTTP
2μl100nM寡核苷酸引物F
2μl100nM寡核苷酸引物R
1μl重组质粒pGEX-GO作为模板 2μl的Taq DNA聚合酶
将ddH O加到最终体积为100μl的
中

使用以下参数进行易错PCR过程：

区隔	周期	温度	时间
1	1	94°C	3分钟
2	30	94°C	30秒
		59°C	30秒
		72℃	80秒
3	1	72℃	7分钟

通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μl易错PCR产物检查产物
纯化易错PCR产物，用Bam HI和Xho I I消化，克隆到pGEX-6P-1中，并转化到大肠杆菌DH5α中以构建随机突变体库

图1. PCR的琼脂糖凝胶电泳产物通过第一轮易错PCR和重组质粒。。 PCR产物。泳道1：宽范围DNA标记（500〜12,000bp）; 泳道2-5：易错PCR产物; B.重组质粒。通道1：空载体pGEX-6P-1; 泳道2-11：重组质粒pGEX-GOs 群落。

定点诱变

按如下步骤制备扩增混合物（50μl）：
10μl10x FastPfu 缓冲液（Mg ^{2 +}加）
1μl10mM高纯度dNTPs
1μl100nM寡核苷酸引物F
1μl100nM寡核苷酸引物R
1μldsDNA模板
1μl的FastPfu DNA聚合酶
将ddH 2 O加至最终体积为50μl

定点诱变PCR程序如下参数进行：

区隔	周期	温度	时间
1	1	97°C	2分钟
2	20	94°C	20秒
		54°C	30秒
		72℃	1分钟/kb的质粒长度
3	1	72℃	7分钟

通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μl位点定向诱变PCR产物检查产物
纯化位点定向诱变PCR产物，用Dpn I消化，并转化到大肠杆菌DH5α中。

图2圆柱PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析和突变的质粒。 A. PCR产物。泳道1：宽范围DNA标记（500〜12,000bp）。泳道2：循环PCR产物。 B.突变的质粒。泳道1：空载体pGEX-6P-1; 泳道2：突变的质粒。

DNA改组

获得用于改组的DNA片段。

通过PCR扩增（100μl）如下制备亲本基因：
10μl10×Taq 缓冲液（Mg ^{2 +}加）
2μl10 mM High Pure dNTPs
2μl100nM寡核苷酸嵌套引物F1
2μl100nM寡核苷酸嵌套引物R1 / 1μl有益突变体作为模板
2μlTaq DNA聚合酶
将ddH O加到最终体积为100μl的
中

DNA改组PCR过程如下参数进行：

区隔	周期	温度	时间
1	1	94°C	3分钟
2	30	94°C	30秒
		62°C	30秒
		72℃	80秒
3	1	72℃	7分钟

通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μl产物检查产物
混合〜1μg每种纯化的PCR产物
通过在0℃下超声处理来制备DNA断裂 40分钟以产生片段集合，然后产生DNA片段在100〜200bp之间使用凝胶纯化柱纯化
通过在3％琼脂糖凝胶上电泳10μl产物检查DNA片段

图3.在DNA改组过程中亲本基因与嵌套引物的示意图

通过无引物PCR重组。

按如下步骤制备扩增混合物（50μl）：
10μl10×Taq 缓冲液（Mg ^{2 +}加）
2μl10mM高纯度dNTPs
42μl纯化的片段DNA
1μl的Taq DNA聚合酶
将ddH 2 O加至最终体积为50μl

无引物PCR操作如下参数进行：

区隔	周期	温度	时间
1	1	94°C	3分钟
2	60	94°C	30秒
		40℃	30秒
		72℃	20秒+ 1秒/周期
3	1	72℃	7分钟

检查产物通过电泳5μlPCR产物在1％琼脂糖凝胶。重新组装的产品的涂片在上面延伸亲本基因的分子量应该是可见的。

全长序列的扩增。

按如下步骤制备扩增混合物（50μl）：
10μl10×Taq缓冲液（Mg 2+ + 加） 2μl10mM高纯度dNTPs
1μl100nM寡核苷酸嵌套引物F2
1μl100nM寡核苷酸嵌套引物R2 / 5μl未纯化的重组反应混合物作为模板
1μlTaq DNA聚合酶
将ddH 2 O加至最终体积为50μl

PCR过程如下参数进行：

区隔	周期	温度	时间
1	1	94°C	3分钟
2	30	94°C	30秒
		59°C	30秒
		72℃	80秒
3	1	72℃	7分钟

通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μl产物检查产物
纯化PCR产物，用克隆的BamHI和XhoI I消化转化到pGEX-6P-1中，并转化到大肠杆菌DH5α中以产生DNA shuffling库。

图4.草甘膦氧化酶的示意图基因通过DNA改组。 A.扩增六个变体GO。泳道1：宽范围DNA标记（500〜12,000 bp）; 泳道2-7：编码DNA片段变体GO。 B.DNA断裂。泳道1-8：处理DNA片段通过在0℃下用0至35分钟的5分钟的时间梯度进行超声波处理; 泳道9：20bp DNA梯形标志物（20〜500bp）。 C.DNA的纯化片段。泳道1：20bp DNA梯形标志物（20〜500bp）; 泳道2：DNA 从琼脂糖凝胶纯化100〜200bp的片段。 D.片段无需引物重组。泳道1：宽范围DNA标记（500〜12,000bp）。泳道2：将DNA片段重新装配成a 全长基因60个循环，无引物。 E.重新组装通过标准PCR扩增全长产物。泳道1：宽范围DNA标记（500〜12,000 bp）; 泳道2：具有引物的PCR产物。

筛选
1. 将所得的BceGO突变体文库表达到96个深孔中平板（含有0.6ml Luria-Bertani培养基）中并转移 Luria-Bertani琼脂平板作为相应的拷贝，过夜生长（37℃，300rpm）。
2. 当文化成长饱和，IPTG（终浓度为0.1mM）将噬菌体T7（每个细胞超过100个颗粒）加入96中深孔板以同步重组突变体的诱导随后在37℃下释放宿主大肠杆菌DH5α的裂解摇动6小时
3. 酶联色比色测定（200μl）如下进行：
  159μl裂解细胞提取物
  20μl50mM草甘膦（在连续轮筛选系统中底物浓度梯度递减）
  20μl0.32mg/ml阳离子 - 二噻啶二盐酸盐
  1μl5单位/ml辣根过氧化物酶
  然后在25℃下孵育8小时
4. 在微量滴定板中每个孔在450nm处的吸光度变化测量板并与对照（含有野生型）比较 BceGO或含有空载体pGEX-6P-1）。突变体超越野生型进行进一步的活性分析（图1）。
  
  图5.甘氨酸氧化酶突变体文库的筛选过程

代表数据

表1.对野生型BceGO和通过随机诱变，位点饱和诱变和DNA改组获得的变体测量的甘氨酸和草甘膦的表观动力学参数

	甘氨酸		草甘膦
	k _cat，app（min ^-1）	K m，app（mM）	k _cat，app（min ^-1）	K m，app（mM）
野生型	8.17±0.31	1.04±0.17	5.72±0.42	84.79±4.25
22D11	1.16±0.05	54.6±3.47	2.95±0.21	8.29±0.27
23B1	4.56±0.38	0.99±0.04	7.15±0.62	18.88±2.52
B1R	0.44±0.03	58.5±5. 26	2.78±0.46	2.45±0.15
B2R11	1.86±0.09	105.6±7.31	3.83±0.17	2.77±0.21
B2R14	1.35±0.12	92.5±7. 43	4.16±0.14	2.17±0.37
B2R23	13.02±0.96	101.8±8.29	30.80±1.33	3.80±0.26
B2R81	5.41±0.83	134.4±10.33	7.27±0.75	4.37±0.30
B3S1	5.43±0.79	41.55±3.32	11.67±0.98	0.53±0.03
B3S4	5.68±0.64	80.43±5.01	12.99±1.14	1.37±0.07
B3S6	10.14±1.32	138.1±12.16	13.22±1.78	1.69±0.08
B3S7	2.30±0.31	41.64±2.10	4.63±0.39	0.57±0.02

特别地，B3S1表现出对草甘膦的底物亲和力增加160倍，对草甘膦的催化效率增加326倍并且特异性常数显着增加超过野生型BceGO，实现通过进化有效氧化草甘膦的目标的甘氨酸氧化酶。

笔记

错误率通过改变添加到易错PCR反应中的MnCl 2和未消除的dNTP的量来控制。
设计嵌套引物以扩增用于DNA断裂的亲本基因和来自重组产物的全长序列

食谱

Luria-Bertani培养基
10 g/L胰蛋白酶
5g/L酵母提取物
10g/L NaCl
根据需要加入氨苄青霉素（50mg/L）

致谢

我们感谢博士。 Ziduo Liu和Dexin Kong对本文的宝贵讨论。

参考文献

GST基因融合系统手册。（2002）。 Biosciences，Amersham。
Zhan，T.，Zhang，K.，Chen，Y.，Lin，Y.，Wu，G.，Zhang，L.，Yao，P.，Shao，Z.and Liu，Z.（2013）。通过定向进化改善蜡样芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶的草甘膦氧化活性。 PLoS One 8（11）：e79175。