材料和试剂

生物材料
1. 体细胞胚胎培养
2. 已撤防。含有感兴趣的二元载体的tumefaciens 菌株（例如 EHA101）对于该协议假定载体含有 nptII 可选择标记基因和 uidA 可评分标记基因（例如 pDE00.0201，来自Escobar 等人，2002）。

化学品

具有维生素（ Phyto Technology Laboratories ，目录号：D2470）的驱动剂Kuniyuki核桃（DKW）培养基

卡那霉素硫酸盐（ Phyto Technology Laboratories ，目录号：K378）

Timentin ^®（ Phyto Technology Laboratories ^®，目录号：T869）

4-羟基-3'，5'-二甲氧基苯乙酮（Acetosyringone）（ Phyto Technology Technology Laboratories ，目录号：A104）

Gelzan TM CM（Sigma-Aldrich，目录号：G1910）

（Lonza，目录号：50004）

Bacto Agar/SuperPure ^TM琼脂（BTS，目录号：A01PD）

Proline（ Phyto 技术实验室^®，目录号：D689）

5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸（X-gluc）（Sigma-Aldrich，目录号：B5285）

1M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）

0.5M EDTA（pH 8.0）（ Technology Laboratories ，目录号：E 582）

0.005M铁氰化钾（Sigma-Aldrich，目录号：702587）

0.005M氰亚铁酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P3289）

Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：234729）

吲哚-3-丁酸（IBA）（Sigma-Aldrich，目录号：B-5386）

6-苄氨基嘌呤（BAP）（Sigma-Aldrich，目录号：B-3408）

胰蛋白胨（BTS，目录号：T01PD）

酵母提取物（BTS，目录号：Y02MG）

NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：S271-3）

饱和的ZnSO 4或NH 4 NO 3溶液

10x PCR缓冲液（Applied Biosystems）

PCR引物

dNTPs（Applied Biosystems）

Taq DNA聚合酶（Applied Biosystems）

DNeasy植物迷你包（QIAGEN）

媒体和补充
微生物培养基

土壤杆菌液体生长培养基（LB液体培养基）（参见Recipes）

土壤杆菌生长板（LB固体培养基）（参见Recipes）

植物培养基

司机Kuniyuki核桃（DKW）基础培养基（参见食谱）

毒性诱导培养基（IM）（见配方）

Acetosyringone介质（AS）板（见配方）

KAN/Timentin ^®选择培养基（参见配方）

KAN只选择介质（见配方）

DKW苗培养基（具有1mg/L BAP和0.01mg/L IBA的DKW基础培养基）（参见Recipes）

玻璃和塑料制品

无菌空100×15mm培养皿（VWR International，目录号：25384-342）

无菌空35×10mm培养皿（BD，Falcon ，目录号：25373-041）

无菌一次性50毫升螺旋盖离心管（BD，Falcon ，目录号：352070）

无菌一次性棉塞10 ml移液器

塑料移液管吸头（20,200和1000μl）（Rainin，型号：LTS）

无菌一次性6孔多孔板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：08-772-1G）

无菌一次性96孔多孔板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：08-772-2C）

将滤纸切成适合100×15mm培养皿并高压灭菌

将滤纸圆盘切成6孔多壁板的孔的直径并高压灭菌

直径150mm的干燥器（例如Nalgene，目录号：5313-0150）

洋红GA-7容器（Magenta Corp.）

设备

分光光度计（例如Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec 3000）

实验室离心机（例如Sigma-Aldrich，Laborzentrifugen Laboratory Centrifuge 3K 10）

微离心机（例如，Denville，型号：260D）

用于电泳的连续电源装置（例如Thermo EC，型号：EC 105和Hoefer，型号：HE 33 Mini Submarine unit）

用于琼脂糖凝胶的电泳单元（例如Fisher Scientific，型号：03-500-124,03-500-132和03-500-134）

层流罩（例如 EdgeGard，Baker，型号：EG3252）

Pipetman 20,200和1,000μl（Rainin，型号：LTS）

分析余额（例如 Mettler Toledo，型号：AT261 DeltaRange ）

顶部载入电子天平（例如 Mettler，型号：PM 2000）

pH计（例如 Corning Pinnacle，型号：540）

恒温培养箱（如 Napco，型号：301）

水浴（例如Thermo Scientific，型号：2870）

涡旋混合器（例如：Scientific Industries，型号：G 560）

冷冻（ - 80°C）（如 New Brunswick，型号：U 700 Premium）

程序

获得主动繁殖核桃体细胞胚胎培养物或从合子胚或套组织启动新的培养物（Dandekar等人，1989; Mendum和McGranahan，1995; Leslie等人， 2006）。
开始转化前几天：

Streak农杆菌在具有适当抗生素的LB平板上产生。在28℃孵育48小时

培养足够数量的所需基因型的胚胎

准备适当的抗生素。

使LB液体介质。

共培养液体培养基。

制作DKW basal，AS和选择介质。

变革开始前一天：
选择胚胎：选择60-70或更快速生长，小，白色，均匀的胚胎（图1A），并将其放置在新鲜的DKW基础培养基上。
第1天（制备液体培养物）

将每个土壤杆菌菌株接种到含有20ml LB培养基的50ml锥形离心管中。

将加盖的管放在旋转振荡器上，在约200rpm，25℃

2小时后，向所用载体中加入合适的选择性抗生素，并返回振荡器。

第2天

振荡过夜后，细菌培养物应是混浊的。确定培养物的10μL-1稀释液的Abs 600nm。

对于60-70胚胎，约25ml共培养悬浮液将被利用。所述共培养悬浮液的所需Abs 600nm 是〜0.5（0.5的Abs 600nm读数大约相当于2.5x 10 8个细菌/ml）。为了计算所需的过夜培养体积，使用以下公式：

（共培养悬浮液的需要的Abs <600> <600> > （农杆菌培养物的Abs <600nm）×（稀释因子）

对于例如：如果你需要25毫升的共培养悬浮液浓度为2.5×10 8个细菌/ml，以1:10稀释的土壤杆菌培养物的等分试样得到的A 600读数为0.371，如何大多数土壤杆菌文化你需要稀释才能使用？

（25）x（0.5） = 3.36 ml
（0.371）×（10）

使用无菌移液管，放置计算体积的农杆菌培养成无菌塑料50ml离心管并离心 10分钟（4,000转/分钟）和环境温度下使细菌沉淀

将上清液倒入或吸取到废物容器中并重悬所述沉淀在共培养培养基中。丸更容易通过小心吸取重悬于小体积（0.5ml第一），然后使溶液达到所需的最终体积

将管在约200rpm下在25℃下返回旋转振荡器1-2小时。

共培养

将所需数量的胚胎放入无菌六孔的孔中多孔板。井应该不超过一半胚胎（约20-23胚胎）。每个使用多个孔在污染问题的转变。变换多个基因型可以在同一板的不同孔中进行但如果使用多个细菌载体，建议使用单独以避免交叉污染。

分配适当体积的农杆菌共培养悬浮液（约8 ml，或足以覆盖胚胎）移液器带棉塞端。

在环境温度下孵育至少10-15分钟（图1B和注释1）。

将无菌滤纸置于与所用孔数相同的空无菌培养皿中

将尽可能多的过量共培养液体从每个孔中取出进入废物容器。

将胚胎从每个井转移到Petri的滤纸上板使用无菌镊子。这将灯芯过度共同培养液体从胚胎。

转移胚胎标记板的AS培养基（每板约10个），并将板置于黑暗中在20-22℃下48小时（参见视频1）。

视频1.核桃转化

第4天：选择
共培养48小时后，将胚转移至含有200mg/L卡那霉素和200mg/L Timentin的KAN/Timentin培养基平板（见注2）。根据选择标记基因，可以使用其它选择培养基（参见注释3）。在环境温度（20-24℃）下在黑暗中孵育培养板。
第6天及以后：

转移胚胎到新鲜KAN/Timentin培养基，两天后后额外五天。这有助于减少细菌过度生长。然后将胚转移到新鲜的KAN/Timentin培养基中每周8-12周。

随着新的体细胞胚开始发育从原始（E ）胚胎的表面，将它们与胚胎分离亲代胚胎。将这些新胚胎标记为E 胚胎。重复此操作过程再生一代（E 胚胎;图1C）。

后 8-12周的选择，胚胎可以移动到选择培养基仅含卡那霉素。仔细观察胚胎培养物接下来几周以确保没有残留的土壤杆菌存活。

GUS表达的评分

当E sub 2胚胎出现时，测试它们用于GUS（ uidA ）活性（Jefferson，1987）。

吸取40μlX-gluc染色溶液（见配方）到无菌96孔多孔板的孔中。

使用细点解剖刀去除一小块组织（子叶尖端工作良好）从每个良好形成并且健康的感兴趣的E 2/2胚胎。将组织片放在X-gluc溶液中，并标记和标记切除胚胎的位置。

在37℃孵育并监测蓝色的发展。颜色变化应在10分钟至2小时内显现（图1D）。

如果组织片显现出独特的蓝色，则从其切割的E 2子胚应当分离并增殖选择培养基，直到E 胚胎可用于DNA分析。

图 1.核桃转化。 A.具有良好发育的子叶的胚胎准备转型。 B.共生培养悬浮液中的Embyos。 C。发育二次胚胎（E 1和E 2）的原代胚胎（E ）。 D. GUS 测试，转化的胚胎在X-Gluc溶液中变成蓝色。

基于PCR的转化验证

选择来自不同胚胎系的活跃增殖的E 胚胎，并用于DNA分离。

使用DNeasy Plant Mini Kit根据制造商的说明书分离总DNA

使用适当的引物进行PCR以确认存在 nptII基因（或其他感兴趣的基因）。设置PCR反应使用在每25μlPCR反应中含有250ng基因组DNA。

PCR后完成后，对5μlPCR产物进行电泳以验证放大适当大小的带。来自未转化的DNA 胚胎可用作阴性对照（图2）

图2。转基因本性的确认。 PCR产物的琼脂糖凝胶显示在APh3/Aph4引物的转化株系8A和1A中的790bp条带。阴性对照或未转化的细胞系不显示任何条带。

体细胞胚发芽和植物生产

在转化的验证后，从所需的胚胎中选择一些E 3 胚胎系可以干燥以引发萌发。选择良好形成的体细胞胚，并将其放置在35×10mm无菌Petri 平板无培养基。覆盖板，但让它们开封（不要用Parafilm ^®包装），并将其在环境温度下置于黑暗中（20-24℃）在包含10-15ml的良好密封的干燥器的架子上的饱和ZnSO 4或NH 4 NO 3在底部（图3A）。

后胚胎变成不透明的白色（通常2-7天）去除胚胎从干燥器和将它们放在DKW射击介质上洋红GA-7容器或培养皿。

在冷白色荧光灯（16小时天长度，〜100μE）下在环境温度下培养2至8周

大多数胚胎会产生根，但通常少于10％胚胎发育芽。根在7-10通常会从胚胎出现天（图3B）。

完全发芽的胚胎拥有两者根和芽应尽快从培养基中除去并种植在盆栽土壤（例如UC Mix，25％：42％：33％沙：冷杉）中树皮：泥炭藓）。或者，可以切除上胚轴，微量繁殖在DKW苗培养基上，然后根生生根多个植物。

为了适应环境，将植物在100％湿度的土壤中保持2周，然后逐渐降低湿度。

建立的植物可以根据需要转移到较大的容器中，并保存在温室或板条房中

图 3.使用致畸体细胞胚的植物生产。 A。干燥胚胎在干燥剂B中。转化核桃体细胞胚胎。

笔记

当体细胞胚用于转化时，物理伤害不是必需的

在每个板上以良好间隔的模式转移胚胎，使得如果Timentin抗性细菌开始增殖，它们不会移动到板上的所有胚胎。

如果进行共转化以同时插入两个基因，潮霉素B（25mg/L）可以作为替代卡那霉素的备选选择标记或作为第二选择标记。

硫酸卡那霉素在溶液中具有非常高的pH。如果以大于100mg/L的浓度使用以进行选择，则在过滤灭菌之前用稀HCl调节卡那霉素储备溶液的pH至5.5。

食谱

硫酸卡那霉素（50mg/ml母液）
5g溶解在100ml dH 2 O中过滤灭菌
储存于-20°C，以10-15 ml等份

特美汀（100mg/ml母液）
6.2g溶解在62ml dH 2 O中过滤灭菌
储存于-20°C，以10-15 ml等份

100 mM乙酰丁香酮 19.6mg溶解在1ml 95％EtOH中使用有盖离心管和涡流
parafilm
在室温下贮存

X-Gluc染色溶液将X-Gluc溶解于0.3％w/v的二甲基甲酰胺溶液中
用含有0.006％Triton X-100和0.5mM K + Fe氰化物的100mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）稀释，制成1mM X-gluc工作溶液。
过滤灭菌
储存冷藏

吲哚-3-丁酸（IBA）（0.1mg/ml母液） 10mg溶解在100ml中
将IBA粉末溶解在几滴1N KOH中用dH 2 O稀释

6-苄氨基嘌呤（BAP）（1mg/ml母液）
25mg溶于25ml
将BAP粉末溶解在几滴1N KOH中用dH 2 O稀释

媒体
司机Kuniyuki核桃（DKW）基础培养基
使1 L：
5.32g DKW基础培养基，其中维生素粉末溶于dH 2 O中 30克蔗糖 pH至5.5，使用1N KOH
2.2 g/L Gelzan ^TM
高压灭菌并倒入40×100×15mm培养板中

LB液体培养基
要做到100毫升
1克胰蛋白胨
0.5g酵母提取物
1克NaCl
pH 6.8-7.2
高压灭菌器

LB生长板
要做到100毫升
1克胰蛋白胨
0.5g酵母提取物
1克NaCl
0.8g Bacto 琼脂
pH 6.8-7.2
高压灭菌并倒入100 x 15 mm培养板中

毒性诱导培养基（IM）
使500毫升
2.66克DKW基础培养基和维生素粉末
15克蔗糖 0.5ml100μM乙酰丁香酮（使1μM终浓度）
575mg脯氨酸（使1mM终浓度）
pH 5.2，使用1N KOH
过滤灭菌
储存冷藏（4℃），以50ml等分

Acetosyringone培养基（AS）培养板
使1 L
5.32克DKW基础培养基与维生素粉末
30克蔗糖 1 ml 100μM乙酰丁香酮（在高压灭菌前加入） pH至5.5，使用1N KOH
2.2 g/L Gelzan ^TM
高压灭菌并倒入100 x 15 mm培养板中

KAN /特门汀选择培养基
使1 L
5.32克DKW基础培养基与维生素粉末
30克蔗糖 pH 5.5，使用1N KOH
分配到1L螺旋盖瓶（每瓶500ml）
1.1 g Gelzan ^TM到每个瓶子
高压灭菌，并在水浴中冷却至60℃。
然后加入200mg/L pH调节过滤灭菌的卡那霉素和200mg/L过滤灭菌的特美汀（见注4）。
充分混合并倒入无菌的100×15mm培养皿中。
固化后，将其储存在原始塑料套筒中，直到准备使用

KAN只选择介质
与KAN/Timentin选择培养基相同，但没有Timentin

DKW拍摄媒体
使1 L
5.32g含维生素粉的DKW基础培养基
30克蔗糖 1mg/L BAP和0.01mg/L IBA
pH至5.5 2.1 g/L Gelzan ^®
微波直到介质沸腾
在搅拌板上彻底混合
分配到Magenta Corporation GA7容器（每个约30ml培养基）高压灭菌器

致谢

注意，类似的方案已由Leslie等人（2006）和Dandekar等人（1989）描述。

参考文献

Dandekar，A.M.，McGranahan，G.H.，Leslie，C.A。和Uratsu，S.L。（1989）。土壤杆菌 - 介导的体细胞胚转化作为转基因植物的生产方法。组织培养方法 12（4）：145-150

Escobar，M.A.，Leslie，C.A.，McGranahan，G.H.and Dandekar，A.M。（2002）。在核桃中沉默冠状病（ Juglans regia L。）。 Plant Science 163（3）：591-597。

Jefferson，R.A。（1987）。在植物中分析嵌合基因：GUS基因融合系统。 Plant Mol Biol Rep 5（4）：387-405。

Leslie，C.A.，Uratsu，S.L.，McGranahan，A.M。，和Dandekar，G.H。（2006）。 Methods Mol Biol 。 In：Wang K.（ed）。 A grobacterium protocols 2nd ed， 2。 Humana Press，Vol。 344：297 -312。

Mendum，M.L。，和McGranahan，G。（1995）。克隆钱包的体细胞胚胎发育核桃研究会，加利福尼亚核桃委员会 25- 27.