材料和试剂

干油菜子（
Brassica napus ）种子样品
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：31248-500G）
甲醇-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：33050-U）
己烷（Sigma-Aldrich，目录号：10549380）
甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：650579）
十五烷酸（Nu-Chek，目录号：N-15-A）
十七烷酸（Nu-Check，目录号：N-17-A）
脂肪酸标准（Supelco 37组分FAME混合物）（Sigma-Aldrich，Supelco，目录号：47885-U）
6ml螺旋盖玻璃小瓶（Schott AG，VWR，目录号：391-0140）
用于6ml螺旋盖小瓶（SKS-Science，目录号：240409）的有机溶剂耐受性盖。
GC柱（BPX70）（SGE Analytical Science，目录号：054600）
98％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
80％乙醇（v/v）稀释在蒸馏水中
用蒸馏水稀释的50％乙醇（v/v）
0.1M NaOH（4g/L）在蒸馏水中的溶液
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：484016）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
腺苷-5'-三磷酸（ATP）（Roche Diagnostics，目录号：10 127 531 001）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）（Roche Diagnostics，目录号：10 240 35 4001）
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶II级（G6PDHII）（Roche Diagnostics，目录号：10 737 232 001）（80μl，在200μl缓冲液B中离心并重悬沉淀）
己糖激酶（HK）（Roche Diagnostics，目录号：11 426 362 001）（120μl，在200μl缓冲液B中离心并重悬沉淀）
磷酸葡萄糖异构酶（PGI）（Roche Diagnostics，目录号：10 128 139 001）（60μl，在200μl缓冲液B中离心并重悬沉淀）
转化酶（INV）（Sigma-Aldrich，目录号：I4504）（尽可能溶解于200μl缓冲液B中）
60 mg/ml ATP在蒸馏水中的溶液
36mg/ml NADP的蒸馏水溶液
缓冲区A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）
试剂混合物1（见配方）

设备

气相色谱仪（GC）（Agilent，型号：7890A）
MinispecMQ20（Bruker Corporation）
机器人样品处理系统（Rohasys BV）
离心机
对于"蔗糖和蛋白质含量测定"程序：Eppendorf离心机5415R（Eppendorf，目录号：022621408）
对于"种子FA含量和组成的确定"程序：Eppendorf Centrifuge 5810 R（Eppendorf，目录号：5811000.010）
Vortex-Genie 2振荡器（Scientific Industries，Cole-Parmer，catalo g number：UY-04724-05）
2ml Eppendorf管（Sigma-Aldrich，目录号：T2795，但不重要）
微孔板96孔（Sigma-Aldrich，目录号：M4561，但不重要）

程序

种子FA含量和组成的测定
1. 将0.4-2毫克种子等分到6毫升螺旋盖玻璃小瓶中
2. 加入10μl十五烷酸或十七烷醇标准品（1μg/μl储备在甲苯中）选择这些FAs作为标准的原因是它们不存在于拟南芥种子中，并且在GC分析期间不与其它脂肪酸甲酯（FAME）重叠。
3. 加入1ml 1N甲醇-HCl
4. 在80℃下加热1.5小时以产生FAME。
5. 加入200μl己烷（100％）
6. 加入1.5ml的0.8％KCl并涡旋10秒重要的是按此顺序加入己烷和KCl以避免假象。
7. 在室温下以2,000rpm离心2分钟以诱导相分离。
8. 移取150μl上层相并转移至GC小瓶
9. 使用以下参数在GC柱上运行：150℃0.1分钟，以4℃/分钟升温至190℃。
10. 分析数据并确定每个种子的FA含量。
11. 不同FA的保留时间可以通过咨询文献或运行标准来确定关于酰基脂质代谢的拟南芥书章的图15显示了拟南芥种子油的GC分析的结果（Li-Beisson等人 >，2010）。
  在Sigma-Aldrich网站上，描述了不同GC柱上的Supelco 37组分FAME混合物的分离(http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Supelco/Bulletin/t196907.pdf）。

通过低分辨率时域NMR光谱法测定种子油和水分含量

根据ISO 10565：1998标准构建油和水分校准（ http：//www .iso.org/iso/catalogue_detail.htm？csnumber = 26317 ）。使用九个约0.5gr种子样品（含水量在5％和10％之间，含油量在约30％和55％之间（r ² = 0.99）。
测量0.5克干燥种子的油和水分含量。
使用9％的水含量作为参考，归一化种子百分比油含量

提取蔗糖和蛋白质含量测定

取10-20完整种子（最小）的样品在安全锁2 ml Eppendorf管
加入250μl的80％乙醇
涡旋30秒。
在80℃下加热样品20分钟
在室温下以23,000g离心5分钟
转移上清（S1）在另一个2毫升的Eppendorf管在冰上
加入150μl的80％乙醇。
涡旋30秒。
在80℃下加热样品10分钟
在室温下以23,000g离心5分钟
转移上清（S2）在相应的管在冰上
加入250μl50％乙醇。
涡旋30秒。
在80℃下加热样品10分钟
在室温下以23,000×g离心5分钟
转移上清（S3）在相应的管在冰上
将含有S1 + S2 + S3的试管存放在-20°C
向沉淀中加入400μl0.1M NaOH

糖和蛋白质含量测定（方法优化微孔板96孔）

糖含量测定
1. 在每个井中分配：
  50μl乙醇提取物（根据您的估计浓度）
  蛋白质浓度取决于样品分离的物种。您可以在文献中检查您感兴趣物种的种子中的蛋白质含量
2. 160μl试剂混合物1
3. 在340nm处读取OD 10分钟（直到OD稳定）
4. 每孔加入1μlHK
5. 在340nm处读取OD，直到OD稳定（通常25分钟）
6. 每孔加入1μlPGI
7. 在340nm处读取OD，直到OD稳定（通常25分钟）
8. 每孔加入1μlINV。
9. 在340nm读OD，直到OD稳定（通常1.5小时）。
10. 计算。
  蔗糖的校准曲线（一式两份）：200,100,50,25,12.5,6.25μg/ml（在缓冲液中）
  或使用下式：μmolNADPH =ΔOD/（2.85 ¹ * 6.22 ²）
  ¹：微孔板的路径长度
  ²：NADPH摩尔消光系数
蛋白含量测定
1. 将样品在95℃下加热30分钟
2. 冷却并在室温下以23,000×g离心5分钟
3. 使用5-10μl的上清液。
4. 按照来自Thermo Scientific TM Pierce TM BCA TM蛋白测定（23227）的方案
5. 注意：在0.1 M NaOH中适当稀释标准品

食谱

缓冲区A
1 M HEPES/KOH
30mM MgCl 2（pH 7.0）
缓冲区B
0.1 M HEPES/KOH
3mM MgCl 2（pH 7.0）
试剂混合1
15.5 ml缓冲液B
480μlATP
480μlNADP
200μlG6PDHII

致谢

这项工作是由生物技术和生物科学研究委员会（研究所战略计划赠款和拨款号BB/E022197/1）支持。用于测定种子FA组成的方案改编自Browse等（1986）。

参考文献

Baud，S.，Boutin，J.-P.，Miquel，M.，Lepiniec，L。和Rochat，C。（2002）。拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型WS中种子发育的综合概述。植物生理生物化学（Plant Physiol Biochem）40（2）：151-160。

Browse，J.，McCourt，P.J.and Somerville，C.R。（1986）。在组合消化后确定叶脂质的脂肪酸组成，并从新鲜组织形成脂肪酸甲酯。/a> Anal Biochem 152（1）：141-145。

Li-Beisson，Y.，Shorrosh，B.，Beisson，F.，Andersson，MX，Arondel，V.，Bates，PD，Baud，S.，Bird，D.，Debono，A.，Durrett，TP，Franke ，RB，Graham，IA，Katayama，K.，Kelly，AA，Larson，T.，Markham，JE，Miquel，M.，Molina，I.，Nishida，I.，Rowland，O.，Samuels， Schmid，KM，Wada，H.，Welti，R.，Xu，C.，Zallot，R。和Ohlrogge，J。（2010）。酰基脂质代谢。 Arabidopsis Book 8：e0133。

van Erp，H.，Kelly，AA，Menard，G.and Eastmond，PJ（2014）。三酰基甘油代谢的多基因工程促进拟南芥中的种子油含量。植物生理学165（1）：30-36。