材料和试剂

培养的细胞如巨噬细胞系THP1
SensoLyte 520 TACE（α-分泌酶）活性测定试剂盒*荧光*（AnaSpec，目录号：72085）
套件中使用的组件：
1. 组分A QXL TM 520/5-FAM（TACE底物，Ex/Em = 490nm/520nm）
2. 组分B 5-FAM，荧光参比标准品（Ex/Em = 490nm/520nm）
3. 组分C测定缓冲液
Triton-X 100（Sigma-Aldrich，目录号：T8532）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）

设备

96孔黑色微孔板（用于荧光分析）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655077）
管/小瓶单向旋转器（Glas-Col，目录号：099A RD4512）
细胞提升器（聚乙烯，无菌）（Corning Incorporated Costar，目录号：3008）
1.5ml微量离心管（聚丙烯）（USA Scientific，目录号：1615-5599）
具有检测范围（激发490nm和发射520nm）（由SensoLyte 520 TACE活性测定试剂盒推荐的设置）（Thermo Fisher Scientific，Fluoroskan Ascent TM）的微板荧光计（用于TACE活性测定）

程序

遵循制造商手册中的方案B，并详细描述如下：

准备细胞裂解液
1. 该测定所需的贴壁细胞的量为12孔板的一个孔中每个实验样品的约3×10 5个或70〜80％汇合的细胞。
2. 向组分C测定缓冲液中加入0.1％（v/v）Triton-X 100
3. 用选择的治疗诱导TACE活化后，除去培养基; 用PBS洗涤细胞; 提起细胞，收集到1.5ml微量离心管中，并用200μl组分C测定缓冲液裂解。（对于所用的实验样品，需要根据经验确定测定缓冲液的量。）
4. 在4℃下在单向旋转器上孵育细胞悬浮液10分钟
5. 在4℃下以2,500xg离心裂解的细胞。
6. 将含有蛋白质样品的上清液收集到新的1.5ml微量离心管中
准备工作解决方案
注意：所有试剂盒组件应在开始实验前解冻至室温。保护光敏材料免受环境光照射。
对于TACE底物溶液，在测定缓冲液（组分C）中稀释TACE底物（组分A）1:100 注意：对于每个实验，准备新的底物溶液。
建立TACE酶反应
1. 设置至少三次酶反应。
2. 加入50μl蛋白质样品（步骤1f收集的上清液）到黑色96孔板中
3. 设置50微升空白对照含有测定缓冲液（组分C）。空白对照孔荧光读数考虑了由测定缓冲液贡献的背景荧光。在这种情况下，空白对照用作仅由用于裂解细胞的测定缓冲液组成的试剂空白;一般来说，通常从每个样品的吸光度读数中减去该溶液的吸光度读数，以便仅考虑您试图分析或测量的物质。
4. 在黑暗中，用5-FAM荧光参考标准品设置50μl阳性对照：在测定缓冲液（组分C）中稀释1mM 5-FAM（组分B）至4μM。进行2倍连续稀释以获得2,1,0.5,0.25,0.12和0.06μM的浓度，包括测定缓冲液空白。每孔加入50μl这些系列稀释的5-FAM参比溶液。保护管和板免受环境光照。
5. 在实验室工作台上，将板在室温下预温育10分钟，避免环境光照射
测量TACE活动
使用平衡至室温的TACE底物溶液。添加50微升的TACE底物溶液到每个孔（每个井现在包含总体积100微升）。通过用手轻轻摇动30秒来混合板中的试剂。
通过在Ex/Em = 485nm/538nm处测量荧光强度立即定量TACE酶活性。
检测蛋白质浓度
使用蛋白质定量方法，例如Bradford测定，测量在步骤1c-f（He，2011）中制备的细胞裂解物的每个实验样品中的总蛋白质浓度。
数据分析
空白对照孔荧光读数考虑了由测定缓冲液贡献的背景荧光。减去每个样品的空白的背景荧光读数，以便仅考虑测量的TACE活性。将每个实验样品的相对荧光单位（RFU）标准化为其总蛋白浓度。将数据绘制为TACE活性RFU /μg蛋白质，如图1所示

图1. TACE活性（RFU /μg蛋白）的图示例

笔记

Ex/Em = 485nm/538nm用于检测细胞裂解物中的荧光。设置从SensoLyte 520 TACE活性测定试剂盒（激发490nm和发射520nm）推荐的那些修改，因为在该实验中使用的Fluoroskan Ascent TM荧光读板仪限于这对激发/发射设置。
测量TACE活性可以从0至15分钟重复几次以捕获最佳读数。 TACE活性的动力学读数应该根据您的实验系统经验确定。

食谱

磷酸盐缓冲盐水[PBS，0.9％（w/v）氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液]

NaCl
8.00克

KCl
0.20克

Na HPO ₄
1.44克

KH ₂ PO ₄
0.24克

去离子水800 ml
用HCl或NaOH调节pH至7.4 去离子水至1升

致谢

该协议改编自以前发表的论文Xu et al。（2014）。本研究部分得到NIEHS/NIH（R01ES017328），NCI/NIH（R01CA142649）和美国能源部（DE-FG02-09ER64783）科学办公室（BER）的资助。

参考文献

他，F.（2011）。 Bradford Protein Assay 生物协议 1（6）：e45。
Xu，X.，Padilla，M.T.，Li，B.，Wells，A.，Kato，K.，Tellez，C.，Belinsky，S.A.，Kim，K.C.and Lin，巨噬细胞中的MUC1：对香烟烟雾诱导的肺癌的贡献癌症 Res 74（2）：460-470。