材料和试剂

5'N-AlexaFluor488-标记的寡脱氧核苷酸（由Integrated DNA Technologies定制合成）
实施例：5'-/5Alex488N/ATA ATA ATA ATA ATA ATA ATA TCC ATA ATA ATA ATA ATA ATA-3'，PAGE纯化，250nmol合成规模（参见Recipes）（尽管这里描述了48-碱基寡脱氧核苷酸，毫无疑问，可以使用更长和更短的寡脱氧核苷酸）
无核酸酶或高压灭菌的无菌水
1U /μl尿嘧啶DNA糖基化酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0361）
0.6 N NaOH
2x RNA加载染料（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0641）
10bp DNA梯（Life Technologies，目录号：10821-015）
Tris（Sigma-Aldrich）
NaCl（Sigma-Aldrich）
DTT（Sigma-Aldrich）
Novex TBE-UREA凝胶（Life Technologies，目录号：EC6885BOX/EC68852BOX）
硼酸
EDTA
10x脱氨酶缓冲液（参见配方）
10x尿嘧啶DNA糖基化酶反应缓冲液（参见配方）
10x Tris硼酸盐EDTA（TBE）缓冲液（见配方）
N-AlexaFluor标记的寡脱氧核苷酸（参见Recipes）

设备

无RNase和DNase的0.5ml微量离心管
37°C水浴
加热块设置为95°C
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis apparatus（Life Technologies，目录号：EI0001）
Powerpac基本电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：164-5050）
Typhoon Imager（Trio +，可变模式成像仪）（GE Healthcare，目录号：2340730）

程序

如下在0.5ml微量离心管中设置10μl脱氨酶测定反应。首先准备脱氨酶测定主混合物，具有足够的体积用于所有反应加上一些过量。下表给出了10个反应的主混合物的配方，尽管为11个反应制备了足够的主混合物（99μl）：

脱氨酶测定组件	每次反应金额	主混音
水	7.5μl	82.5微升
10x脱氨酶缓冲液	1微升	11微升
荧光标记的寡核苷酸底物（10pmol /μl）	0.5μl	5.5微升

将9μl主混合物分配到每个管中;然后向每个管中加入1μl待测定的蛋白质制备物。根据我们的经验，在该测定中，大约0.25μg的小鼠APOBEC3足以使大部分寡脱氧核苷酸底物脱氨基。（无蛋白，"空白"对照反应也应制备添加蛋白缓冲液，而不是蛋白质。）
通过上下吹吸轻轻混合反应物，如果需要，快速旋转以收集管底部的所有内容物。将反应在37℃水浴中孵育2小时注意：在37°C孵育2小时时，偶尔会以低速离心管中的内容物，因为水分会由于蒸发而积聚在管帽上。

按下表所示制备UDG主混合物。例如，如果进行10次测定，则准备55μlUDG主混合物，即足以用于5μl/反应+5μl过量体积：

UDG酶组合
每次反应金额
主混音

水
2.75微升
30.25微升

10x UDG缓冲区
1.5μl
16.5微升

UDG酶（1U /μl）
0.75μl
8.25μl

将5μl该UDG主混合物加入到步骤1的10μl脱氨酶测定反应管中。轻轻混合反应物，并在37℃水浴中孵育45分钟。
在45分钟孵育后，向每个管中加入5μl的0.6N NaOH，并在37℃下进一步温育20分钟。
向每个管中加入等体积（20μl）2x RNA加载染料，在95℃加热2-3分钟，立即置于冰上。
将15μl每种样品加载到15％TBE-UREA PAGE凝胶上，并通过在150伏在室温（25℃）下在1x TBE缓冲液中电泳3小时来分解切割和未切割的产物。（在装载样品前，使用带针头的注射器用运行缓冲液冲洗孔，从孔中除去残留的尿素或丙烯酰胺，并使样品在凝胶上涂抹的概率最小）。
为了可视化未裂解的底物和裂解产物，从铸件中小心地除去凝胶，在底部切下密封凝胶末端，并将凝胶置于干净的玻璃板上。小心地在胶上放置保鲜膜/通过轻轻地滚动辊（与凝胶装置一起提供）或巴斯德吸管在其上除去凝胶和膜之间的任何气泡。气泡倾向于干扰荧光成像。避免气泡和防止凝胶干燥和破裂的一个窍门是在放置保鲜膜之前，将几滴水大量地放在凝胶上。
将凝胶放在荧光读数器上，凝胶侧面向扫描仪，玻璃面朝上。扫描仪应设置为AlexaFluor 488（激发495 nm，发射519 nm），PMT 600，灵敏度正常，扫描速度200微米。

代表数据

代表性的凝胶如图1所示。一般来说，我们发现这种测定是非常稳定和可重复的。

图1.用两个48-碱基寡脱氧核苷酸测试小鼠APOBEC3。第一个（左图）完全由A和T残基组成，除了残基25-27，其是TTC，并且用AlexaFluor标记488在其5'端。将寡核苷酸与无蛋白（第一泳道）和在Sf9细胞中产生的小鼠APOBEC3（第二和第三泳道）一起温育。第二泳道显示了该温育的结果，随后是本文所述的完全测定方案，而第三泳道显示了当从测定中省略UDG时的结果。右图显示了相似的测定，但是除了A和T残基之外，寡核苷酸还包含残基21-24的TCCC和残基28-31的TTCC。

笔记

尽管我们在此描述的测定法监测了在其5'末端具有荧光团的底物寡脱氧核苷酸的脱氨基，但是许多研究者已经使用5'→32 P标记的寡脱氧核苷酸，而通过放射自显影测量切割，比荧光成像。一些研究人员可能发现这比使用荧光更方便或更经济。但是，两种方法中使用的原理和大多数过程是相同的。
作为测定的阳性对照，可以设计与底物（材料和试剂）相同的寡核苷酸，除了其含有尿嘧啶而不是胞嘧啶（5' -/5Alex488N/ATA ATA ATA ATA ATA ATA ATA ATA TUU ATA ATA ATA ATA ATA ATA ATA 3'）。这应该在UDG碱处理中完全裂解;如果不是，这表明治疗不能成功诱导寡脱氧核苷酸中所有脱氧尿苷的切割。
这里的方案（"Procedure"，步骤1的文本）要求加入1μl待测定脱氨酶活性的蛋白质制剂。我们的制备（Nair等人，2014）从Sf9昆虫细胞中部分纯化，通常每μl含有0.5-1μg蛋白质。

食谱

10x脱氨酶缓冲液
100mM Tris.HCl（pH 8.0）
500 mM NaCl
10 mM DTT
注意：Tris，NaCl和DTT均购自Sigma Aldrich。将1M Tris HCl（pH8.0）和5M NaCl的储备溶液高压灭菌并在室温下储存，同时新鲜制备1M DTT溶液并储存在-20℃。

10x脱氨酶缓冲液（1ml）体积（μl）

1M Tris缓冲液（pH8.0） 100

5 M NaCl
100

1 M DTT
10

水
790

此缓冲液应储存在-20°C
10x尿嘧啶DNA糖基化酶反应缓冲液
200mM Tris-HCl（pH8.2，25℃） 10 mM EDTA
100 mM NaCl
供应尿嘧啶DNA糖基化酶
10x Tris硼酸盐EDTA（TBE）缓冲液 108克Tris碱
55克硼酸 40ml 0.5M EDTA（pH〜8.3）
N-AlexaFluor标记的寡脱氧核苷酸这些以干燥的粉末/丸/沉淀物形式提供。溶于无核酸酶或高压灭菌的无菌水至终浓度为1nmol /μl原液。储存于-20°C，在黑暗的试管中。为了避免底物的重复冷冻和解冻，建议制备几个等分试样，每个50μl的工作浓度为10pmol/μl，并在-20℃下在暗管中储存。尽管寡脱氧核苷酸的产量通常仅为量级的2-5％合成，对于测定可能是足够的，因为每个测定反应仅消耗5pmol或甚至更少

致谢

我们感谢Jennifer Miller和Jason Rausch对测定的帮助。这项工作是由国家卫生研究院，国家癌症研究所，癌症研究中心的校内研究计划的支持。

参考文献

Iwatani，Y.，Takeuchi，H.，Strebel，K。和Levin，J.G。（2006）。高纯度，催化活性人类APOBEC3G的生物化学活性：与抗病毒效应的相关性。 em> J Virol 80（12）：5992-6002。
Nair，S.，Sanchez-Martinez，S.，Ji，X。和Rein，A。（2014）。小鼠APOBEC3的生物化学和生物学研究 J Virol 88（7）：3850-3860。