材料和试剂

动物：C57/BL6N雄性小鼠（Janvier Labs）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M-5904）
乙酸异戊酯（香蕉气味）（Sigma-Aldrich，目录号：W205508）
苯甲醛（杏仁气味）（Sigma-Aldrich，目录号：418099）
20％乙醇注意：矿物油被用作溶剂，因为其文献中报道的无臭性质（Linster等人，2009; Qiu等人，2014; Slotnick和Restrepo，2005; Tan等人，2010 ）。杏仁和香蕉气味被用作新颖，中性的气味（Yang等人，2013; Yang和Crawley，2009）。然而，其他气味也适合在我们的条件下测试，如己醛。

设备

用于小鼠的标准单个有机玻璃笼（见图1A）
水瓶盖与不锈钢制成的吸管（从现在称为气味支架，见图1B）（Tecniplast）
滤纸（Thermo Fisher Scientific，见图1C和图2）
不透明的eppendorfs（1ml体积）（Eppendorf，参见图1C）
剪刀
10μl移液器
10μl移液器吸头
纸巾
用于放置测试笼的标准表
CCTV摄像机用于测试的鸟瞰图
标准计算机（PC或Mac）

图1.进行嗅觉习惯测试的基本材料 A）用有机玻璃（12cm宽×30cm长×13cm高）制成的测试笼，其具有圆形穿孔（5cm直径）其中一个极端。 B）由不锈钢制成的气味保持器（从底部到吸管顶部5cm高;底部直径5cm;吸管管的孔直径3mm）。 C）含有气味溶液和用于施用气味的滤纸（3cm高×1cm宽）的标准不透明Eppendorf（左）。将该滤纸引入B）的吸管中

软件

视频录制软件（GrabBee， grabbee.software.informer.com ）
分析探索行为的软件（Behav_Scor_v3.0_beta）

程序

测试笼
1. 在地板中的有机玻璃笼的一个极限中制造圆形穿孔（直径5cm）（参见图1A）。这种修改允许气味保持器放置在桌子和测试笼之间，保持其稳定并且抵抗由鼠标产生的任何压力。
制备气味溶液
1. 通过将1μl的气味（杏仁或香蕉）添加到1ml矿物油（0.1％浓度）中来制备储备溶液，然后将其在Eppendorf管中以50μl批次/批次混合。
2. 使用石蜡膜密封所有的管，以防止从管中蒸发，然后在室温下储存在防护光的纸板箱中。
有香味的滤纸的制备
1. 将滤纸切成小块（1cm×3cm，图1C）。
2. 对于嗅觉习惯测试，使用移液管将5μl稀释的气味剂（0.1％）或矿物油施加到预先切割的滤纸的一个边缘，然后将其放置在气味保持器内部，仅引入三分之二香味滤纸（见图2）。
  注意：重要的是不要完全地将滤纸引入支架中，以避免与小鼠的物理接触（即与舌头）。当这种情况发生时，很可能小鼠会咬住气味源，使得难以对嗅觉进行评分。
3. 三个气味固定器用于测试，一个专用于矿物油，另一个用于香蕉气味，最后一种用于杏仁气味。每次使用后，用20％乙醇清洁支架。
图2.将有香味的滤纸放置在气味固定器内的步骤。滤纸沿其纵向轴线弯曲，然后（三分之二）被引入气味固定器的管中。在将气味固定器放入测试笼之前，请确认滤纸不会改变位置
嗅觉习惯测试
1. 在光循环期间在与容纳室分开的实验室中使用标准温度执行测试。
2. 在第0天，在光周期开始后4小时开始，将动物禁食24小时。
3. 在第1天（测试日）任务前30分钟所有必要的材料（见上文）。将测试笼放置在台上并用20％乙醇清洁。然后，所有的参数涉及视频记录和记分软件，诸如相机聚焦和对比度，测试笼在右侧相机视野中的位置等。
4. 一旦所有设置完成，包含矿物油的第一个支架放置在测试笼中，并开始视频录制。将小鼠放置在测试笼的与气味保持器相对的极端之一中。任务包括暴露于矿物油或气味5分钟间隔5分钟;在此期间，小鼠保持在测试笼中。
5. 在给定的时间段中，首先仅给小鼠提供含有矿物油的持有者。然后在两个连续的试验（习惯性）期间，他们被提供第一种气味剂。随后，它们呈现为第二种气味剂。图3示意了协议的不同步骤。
  注意：第二种气味的呈现反映了动物是否能够区分气味，这是基于动物的探索新气味的倾向，并控制对测试气味的潜在不感兴趣。
图3.嗅觉习惯方案。在到达后立即将小鼠放置在个体笼中一周，每天监测体重和食物摄取。在试验当天，将剥夺食物（24小时）的动物置于测试笼中，并提交第一次矿物油，然后是气味A（杏仁或香蕉）的两倍，最后是气味B（杏仁或香蕉）。每次呈现之后是休息时间，其中不存在气味或油。对气味源的探测时间进行评分。

代表数据

在图4B中给出了代表性的习惯/饮食习惯曲线。气味源的探测被定义为将鼻子指向距离保持器的尖端<1cm的距离，其中震动移动，和/或与鼻子接触。当鼠标咀嚼物体时，不进行探测。
在两次试验之间用20％乙醇清洗测试笼。使用的两种气味剂是按照平衡时间表

图4.禁食小鼠中的嗅觉习惯/直立性。 A）通过禁食小鼠的气味源探测。气味源的探测被定义为将鼻子指向距离保持器的尖端<1cm的距离处，其中震动与鼻子移动和/或与鼻子接触。 B）一组24小时禁食野生型小鼠的代表性习惯/dishabituation曲线。注意在给定气味（杏仁或香蕉）的第二次呈现后，探测（习惯）的减少。在呈现不同的气味（杏仁或香蕉）之后，回收（dishabituation）。

笔记

所有动物在实验前在单笼中饲养至少一周。
在食物匮乏开始时更换床上用品以防止残留食物残留在笼子中
该试验适合于评价禁食小鼠（C57/BL6N）中的嗅觉探查。非禁食小鼠在测试的气味浓度（0.1％）下呈现低水平的探索。
在几个小鼠系中测试嗅觉习惯任务。我们发现在C57/BL6N小鼠比在我们自己的研究所生产的动物更多的变异性。这可能是由于潜在的更高水平的压力，与运输或住房条件有关

致谢

我们要感谢Samantha James和Annelot Van Esbroeck（Neurocentre Magendie）对这份手稿的批判性阅读。该方案根据McNamara等人（2008），Fadool等人，（2004）和Ferguson （2000）。这项工作由INSERM（GM），EU-Fp7（REPROBESITY，HEALTH-F2-2008-223713，GM），欧洲研究理事会（ENDOFOOD，ERC-2010-StG- 260515，GM），Fondation pour la Recherche医疗GM），地区阿基坦（GM），LABEX BRAIN（ANR-10-LABX-43），Fyssen基金会（ES-G），我们感谢Alexandre Desprez的宝贵技术援助。

参考文献

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