材料和试剂

志贺氏菌属。应变（如 M90T）
人组织培养细胞如结肠上皮TC7细胞（Caco-2细胞的克隆）
注意：只有极化的上皮细胞允许志贺氏菌属的有效的细胞到细胞的传播。我们还建议使用人类细胞，因为它是志贺氏菌的唯一自然宿主，虽然其他测试来源的大多数细胞系也容易感染，可能由于实际原因。
补充有0.01％刚果红（CR）（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：27215.01）和合适的抗生素的胰蛋白胨酪蛋白佐剂（TCS）琼脂（BD Biosciences，目录号：236950）
TCS肉汤（BD Biosciences，目录号：211825）
聚赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1274）
DMEM（Life Technologies，目录号：31885）
FCS（Biowest，目录号：S1810-100）
青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15140）
非必需氨基酸（Life Technologies，目录号：11140）
胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，目录号：25200-056）
来自人血浆的纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F0895）（任选）
HEPES（Life Technologies，目录号：15630-056）
庆大霉素（EUROMEDEX，目录号：EU0540-A）
PFA（Electron Microscopy Sciences，目录号：15714）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A 9647）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1393）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：08591）
山羊抗小鼠IgG Alexa568（高度交叉吸收）（Life Technologies，目录号：A11036）
山羊抗小鼠IgG Alexa647（高度交叉吸收）（Life Technologies，目录号：A21236）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：6876）
5,000x DAPI储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）（可选）（参见配方）
MOWIOL（Sigma-Aldrich，目录号：81381）
1,4-二偶氮双环 - [2,2,2] - 辛烷d（DABCO）（Sigma-Aldrich，目录号：D27802）
甘油（VWR International，目录号：24388.295）或长寿命封固剂（Life Technologies，目录号：P36930）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
PBS /10μg/ml聚赖氨酸（见Recipes）
DMEM/20mM HEPES（参见配方）
Chase介质（见配方）
PBS/4％PFA（参见配方）
PBS/100mM甘氨酸（参见配方）
PBS/0.1％Triton X-100（参见配方）
PBS/1％BSA/0.2％明胶（见配方）
溶菌酶反应缓冲液（参见配方）
5,000x DAPI储备溶液（见配方）
安装介质（参见配方）
TC7细胞的生长培养基（参见配方）

设备

24孔板
Coverslips no。 1.5，直径12mm（Harvard Apparatus，目录号：64-0712）
用于细胞培养的层流罩
加热水浴
台式离心机用于1.5ml Eppendorf管
带托板转子的台式离心机
CO 2细胞培养箱中培养
镊子

程序

在文献中有许多研究描述了对细菌内蛋白质进行免疫荧光标记的方案（Buddelmeijer等人，1998; Schlumberger等人，2005）。尽管详细的程序可以变化，但是它们通常使用EDTA和溶菌酶，其使外膜[即LPS，由Nikaido和Vaara（1985）综述]不稳定并降解细胞壁的肽聚糖，因此允许抗体扩散到细菌细胞质中以识别它们的同源抗原。下面我们提出我们已经用于组合检测灵芝志贺氏菌IpaB，IpaC和IpaD的分泌的和细菌内部分的方法。参见参考文献2（Campbell-Valois等人，2014），以应用该程序。

在实验前36-48小时，通过用0.25％胰蛋白酶-EDTA孵育分离汇合的TC7细胞单层（即，表面的100％覆盖），并分布在它们的正常生长培养基（参见Recipes）中无菌12mm盖玻片（CS） 1.5在24孔板的孔内。为了跟踪进入事件，种子为5×10 4个细胞/孔（实验当天大约50-75％汇合）。为了在更长的感染时间促进细胞与细胞的铺展，以1×10 5个细胞/孔种子。（任选的）纤连蛋白包被的盖玻片（CS）可用于促进细胞的附着，但是在这种情况下，接种的细胞数目必须减少大约一半，以获得类似于未涂布的盖玻片。
实验前一天，CR阳性。从TCS-CR板中挑取具有在菌落中心的红色菌落（即在菌落中心具有红色点）的菌落，并用于接种TCS肉汤的管（例如 em，2-8ml）在30℃振荡生长过夜。
注意：CR诱导T3SA激活和效应物分泌;具有活性T3SA的菌落因此显示红色中心，其中CR已经积累，而已经失去毒力质粒的细菌显示为更大的白色菌落（图1）。

图1.刚果红阳性（CR +）对刚果红阴性（CR-）集落将Wt和质粒固化的M90T衍生菌株在含琼脂的TCS和刚果红板上并排划线以显示其不同的表型。左侧的Wt集落形成小和CR +集落（显示红色中心）。质粒固化（BS176菌株）形成大的CR-菌落（白色）
第二天早晨，将ON培养物在不含抗生素的8.0ml新鲜TCS肉汤的管中以1:100传代培养，并在37℃孵育直到OD 600大约为1.0（指数晚期） br />
将2ml细菌培养物（足以感染24孔板的4个孔）以7,500×g离心1分钟，并在1ml PBS中洗涤。重复另外两次离心和洗涤步骤。
在室温（RT）下将细菌沉淀重悬在2ml DMEM-HEPES中
（可选）可以直接对管中生长的细菌进行透化。在这种情况下，简单地将洗涤细菌的1:5稀释液离心5分钟至所需数量的聚赖氨酸包被的12mm盖玻片上（将无菌盖玻片与50μg/ml聚赖氨酸一起孵育PBS在室温下60分钟，在1ml PBS中洗涤三次）;使用聚赖氨酸包被的盖玻片有助于细菌粘附到玻璃表面。地点盖玻片在24孔板中，用PBS洗涤两次并进行固定，如下所述
TC7细胞用DMEM-HEPES（RT）洗涤两次;洗涤后，在37℃下将DMEM-HEPES置于步骤10
将500μlDMEM-HEPES细菌悬浮液加入含有TC7细胞的24孔板的每个孔中。
通过在RT下以450x g离心5分钟使细菌与细胞接触。使细胞与细菌悬浮液在总体上保持接触约10分钟。（任选的）如果需要，可以使用聚赖氨酸包被的细菌代替未包被的细菌的离心。聚赖氨酸包被的细菌可以通过将孵育用1ml PBS（参见步骤4）在PBS /聚赖氨酸（10μg/ml）中洗涤一次的细菌10分钟并温和搅拌并在感染前洗涤细菌三次而快速制备。使用聚赖氨酸处理大大提高了进入效率，因此OD 600等于0.02-0.2的细菌悬浮液应与细胞在RT下温育10分钟，而不进行离心。
吸出细菌悬浮液并用预热至37℃的500μlDMEM-HEPES代替
在37℃下在具有5％CO 2的细胞培养箱中孵育15至30分钟。
吸出并添加追踪培养基所需的时间。为了研究在TC7细胞中的细胞到细胞的传播，推荐210分钟的追踪。
在感染后的所需时间，用PBS洗涤细胞单层一次
在室温（RT）下用200μlPBS/4％PFA固定10分钟
吸出固定剂，在200μlPBS/100mM甘氨酸中孵育5分钟以淬灭PFA。
用500μlPBS洗涤3次。
在200μlPBS/0.1％Triton X-100中孵育4分钟
用500μlPBS洗涤4次。
在200μl封闭溶液PBS/1％BSA/0.2％明胶中孵育CS 15分钟
孵育CS ON在4℃与第一抗体，针对IpaB，IpaC，IpaD或备选地对任何其他分泌的目标蛋白质，稀释在200μl封闭溶液/盖玻片。抗体的稀释是可变的，并且必须对每种抗体凭经验确定。
用500μlPBS洗涤3次。
用与Alexa Fluor 568偶联的适当的二抗孵育120分钟，并在封闭溶液中稀释
在500μlPBS中洗涤3次。
在200μlPBS/4％PFA中孵育5分钟，以使第二抗体和第一抗体交联其抗原，从而避免溶菌酶透化后与细菌池的交叉反应。
在200μlPBS /甘氨酸孵育5分钟
在PBS中洗涤3次。
在37℃下用溶菌酶反应缓冲液孵育CS 20分钟
在500μlPBS中洗涤3次。
在4℃下孵育过夜（ON）或在室温下用针对IpaB，IpaC，IpaD的一级抗体或者针对稀释200μl封闭溶液/盖玻片的任何其它分泌的蛋白质孵育2-4小时。同样，抗体的稀释是可变的，并且必须由用户凭经验确定。
在500μlPBS中洗涤3次。
孵育120分钟与适当的第二抗体偶联Alexa Fluor 647或稀释1/500-1/1,000等价荧光或根据供应商在200μl封闭溶液/盖玻片。在此步骤中，DAPI可在孵育期间以0.2μg/ml添加
在PBS中洗涤3次，并将封固介质加热至37℃
用一对细镊子从培养皿中取出CS，短暂浸入蒸馏水中，用一张吸水纸除去多余的水。
使用10μl预热（37°C）封固剂在载玻片上安装。
让干燥，不要在室温下干扰CS至少一个小时。
储存在4°C，直到准备观察。
预期结果：分泌的部分将出现在Alexa568和Alexa647通道，而细菌内部分只会出现在Alexa647通道。分泌的部分的定位将看起来不同于细菌内部分的定位。由于在标记分泌的和细菌内部分之间的顺序渗透程序和与PFA的交联，可以顺序地使用针对易位蛋白或效应物的相同的一抗来实施该方案，而不损害结果的解释。参见图4C在Campbell-Valois等人（2014）和图2]。在大多数情况下，在其附近具有分泌的易位蛋白或末端蛋白的细菌具有耗尽的细菌存储。观察到有时没有可检测的细菌或分泌贮存的细菌。它们最可能代表最近消耗了细菌存储并且还没有补充其库存的细菌

图2.根据方案获得的标记的实施例在这里，我们显示了使用针对由Wt表达的末端蛋白paD的单个单克隆抗体（A8.1）的上述标记方案获得的最终结果 Shigella flexneri 。箭头指向细菌，其仅具有细菌内IpaD蛋白（+溶菌酶）且没有可检测的分泌部分（ - 溶菌酶）。大箭头指向在其附近具有分泌的IpaD的细菌，并且显示在步骤37中描述的交叉反应，其在溶菌酶处理后系统地观察到在其附近具有分泌的IpaB，IpaC和IpaD的细菌。与类似于箭头所示的细菌相反，由大箭头指示的细菌在其细胞质中不具有IpaD，如标记的中空形状所指示的。
注意：Cerulean是来自Aequoria victoria的绿色荧光蛋白的青色变体，这里由细菌的组成型活性启动子表达。

笔记

结果通常是高度可重复的。然而，为了确保分泌细菌与非分泌细菌的比例在检查后的攻击后的给定时间是恒定的，建议确保感染的细胞在类似的汇合水平下进行研究，因为当细菌不能进行细胞细胞有效扩散，不移动，因此不分泌细菌的比例增加。类似地，感染前的细菌传代培养必须在高度控制的条件下进行，例如通过在每次重复实验时注意停止在相似OD 600的孵育。如果直接对在肉汤中生长的细菌或在攻击后的早期时间点进行标记，因为已知在细菌细胞质中发现的易位蛋白的量在整个指数生长期增加，这是特别重要的。

食谱

10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将80g的NaCl与2g的KCl，14.4g的Na 2 HPO 4，2.4g的KH 2 PO 4
用NaOH调节pH至7.4 将蒸馏的H 2 O加到1000ml
中高压灭菌
灭菌存储在RT
稀释至1倍浓度用于所有用途
PBS /10μg/ml聚赖氨酸
1x PBS
1：1,000的聚赖氨酸储备溶液（10mg/ml，在水中，过滤灭菌并在-20℃下以1ml等分试样储存）
DMEM/20mM HEPES
DMEM
1:50稀释的1 M HEPES
追逐媒体
DMEM
5％FBS
庆大霉素50μg/ml
PBS/4％PFA
10ml PFA（32％）
8ml 10x PBS
将蒸馏的H 2 O加至80ml
等分并存储在-20°C
在4℃下一周后丢弃等分试样
PBS/100mM甘氨酸 0.375g甘氨酸 5ml 10×PBS
将H <2> O加入到50ml ml/h 过滤灭菌（0.2μm）
储存在4°C
PBS/0.1％Triton X-100 500μlPBS/10％Triton X-100储备液
5 ml 10x PBS储备液
过滤灭菌（0.2μm）
将蒸馏的H 2 O加入到50ml的
中储存在4°C
PBS/1％BSA/0.2％明胶
0.5 g BSA
0.1克明胶
50 ml 1x PBS
加入叠氮化钠至最终2 mM
过滤灭菌（0.2μm）
储存在4°C
溶菌酶反应缓冲液
PBS 0.8x从10x PBS储备液中洗涤
50mM葡萄糖 5 mM EDTA
在使用之前立即使用5mg/ml溶菌酶，使用100mg/ml储备溶液分装并储存在-20℃下
5,000x DAPI储液
1ml H 2 O 2 / 1 mg DAPI
安装介质
注意：食谱来自罗切斯特大学医学中心，Michael Mastrangelo，Eric Yehling;详情请参阅 http://www.urmc.rochester.edu/共焦 - 常规显微镜/文件/Mowiol52810.pdf。
24克分析级甘油
9.6g Mowiol 4-88
24ml蒸馏的H 2 O 2 / 48ml 0.2M Tris缓冲液（pH8.5）为了溶解，将溶液完全装入500ml烧瓶中，在60-70℃的加热板上搅拌4-5小时
在每50ml锥形管中以20-40ml等分试样在5,000xg离心15分钟以除去未溶解的残余物并小心地回收上清液
加入2.5％DABCO作为抗漂白剂
在15或50ml锥形管中等分，并储存在-20°C长期贮存
TC7细胞的生长培养基
DMEM
20％FCS
1×青霉素/链霉素 1个非必需氨基酸

致谢

我们感谢Claude Parsot对稿件的意见。 FXCV是CIHR，EMBO，Marie-Curie-IRG和FRM研究员。 PS是EMBO和Marie Curie-IEF研究员，PJS是HHMI高级学者。这项工作是由ERC（PJS高级奖学金，232798号支持）。上述程序最初在Campbell-Valois等人（2014）中描述。

参考文献

Buddelmeijer，N.，Aarsman，M.E.，Kolk，A.H.，Vicente，M。和Nanninga，N。（1998）。通过免疫荧光显微镜在细胞分裂和非分裂细胞中定位细胞分裂蛋白FtsQ，/em>。 180（23）：6107-6116。
Campbell-Valois，F.X.，Schnupf，P.，Nigro，G.，Sachse，M.，Sansonetti，P.J.and Parsot，C.（2014）。荧光记者揭示志贺氏菌III型分泌器官在进入期间的开/关调节和细胞 - 细胞扩散细胞宿主微生物 15（2）：177-189
Nikaido，H。和Vaara，M。（1985）。细菌外膜通透性的分子基础 Microbiol Rev 49（1）：1-32。
Schlumberger，M.C.，Müller，A.J.，Ehrbar，K.，Winnen，B.，Duss，I.，Stecher，B.and Hardt，W.-D. （2005）。 III型分泌物的实时成像：沙门氏菌SipA注射入宿主细胞。 Proc Natl Acad Sci USA 102（35）：12548-12553。